LED紅光照射對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞抗炎反應(yīng)的影響

劉旭文，陳澤慶，黃詩(shī)捷，盧志成，劉木清

(1.復(fù)旦大學(xué)光源與照明工程系，上海 200433；2.復(fù)旦大學(xué)先進(jìn)照明技術(shù)教育部工程研究中心，上海 200433； 3.復(fù)旦大學(xué)工程與應(yīng)用技術(shù)研究院，上海 200433)

引言

發(fā)光二極管 (Light Emitting Diode，LED)具備高效、穩(wěn)定、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于照明、顯示等領(lǐng)域。其安全高效、波長(zhǎng)范圍廣、光譜純、光譜半波帶寬窄的優(yōu)勢(shì)，也使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛，已涵蓋皮膚醫(yī)學(xué)、生物節(jié)律、口腔醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)學(xué)診斷及醫(yī)學(xué)照明等應(yīng)用場(chǎng)景[1-3]。

牙周病是指發(fā)生于牙齦、牙周膜等牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，牙周病病因復(fù)雜，但致病關(guān)鍵是菌斑微生物及其產(chǎn)物長(zhǎng)期作用于牙周支持組織，誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，引起牙周病的優(yōu)勢(shì)菌包括牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、伴放線菌嗜血菌等[4]。人牙齦成纖維細(xì)胞(human gingival fibroblasts，HGFs)在細(xì)菌病原的刺激下會(huì)分泌前列腺素(prostaglandin E2，PGE2)、IL-6、IL-8等炎性介質(zhì)來(lái)參與機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是牙齦卟啉單胞菌的主要成分，因此作為體外模擬牙周炎實(shí)驗(yàn)的高效誘導(dǎo)因子被廣泛采用[5]。

牙周病治療的關(guān)鍵在于去除定植于牙根面上的菌斑及細(xì)菌產(chǎn)物，清除病變的牙周組織，阻止疾病的進(jìn)展，促進(jìn)牙周組織的再生。牙周病治療的第一步是通過(guò)機(jī)械方法去除牙石、菌斑等刺激源，治療方法包括齦上潔治術(shù)和齦下刮治根面平整術(shù)，但口腔內(nèi)部存在器械難以達(dá)到的部位，刮治難以徹底。常需通過(guò)口服或局部應(yīng)用抗生素來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)牙菌斑的控制，易引發(fā)不良反應(yīng)和耐藥性[6]。

Dungel等[7]研究發(fā)現(xiàn)632 nm的LED紅光照射具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、減輕炎癥及促進(jìn)傷口愈合的作用。Komerik等[8]研究發(fā)現(xiàn)625 nm的LED紅光照射可減少炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)牙周組織中的細(xì)胞增殖機(jī)制。Almeida-Lopes等[9]對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)相同能量密度、不同輸出功率下，紅光比其他可見(jiàn)光能誘導(dǎo)更高的細(xì)胞增殖。Li等[10]發(fā)現(xiàn)630 nm的LED光照可以減輕免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Ohsugi等[11]發(fā)現(xiàn)光照能夠抑制與骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人類牙周韌帶細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)的基因表達(dá)，每種目標(biāo)細(xì)胞的合適照射功率都不同。本文主要研究在光照劑量為18 J/cm2的情況下，不同光強(qiáng)度的630 nm紅光照射對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的抗炎反應(yīng)的影響，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.1 LED光照系統(tǒng)

光照系統(tǒng)由觸控屏、信號(hào)控制器、LED驅(qū)動(dòng)器和LED光源組成，觸控屏與用戶交互光照參數(shù)和開關(guān)指令，信號(hào)控制器反饋光源狀態(tài)，處理用戶指令，并控制LED驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)LED光源。光照系統(tǒng)使用信號(hào)控制器能調(diào)節(jié)控制電壓和PWM信號(hào)以控制LED驅(qū)動(dòng)器輸出的工作頻率、占空比和峰值電流，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)光照強(qiáng)度的調(diào)節(jié)。信號(hào)控制器的電壓調(diào)節(jié)范圍為0～2.5 V，調(diào)節(jié)精度0.01 V，對(duì)應(yīng)LED峰值電流值0～2 A；PWM信號(hào)頻率范圍0～20 K，調(diào)節(jié)精度0.01 kHz，占空比調(diào)節(jié)范圍0～100%，調(diào)節(jié)精度1%，對(duì)應(yīng)LED光源工作頻率和占空比。為了達(dá)到細(xì)胞光照實(shí)驗(yàn)所需的均勻度，使用了DIALux軟件對(duì)LED光源進(jìn)行了光學(xué)仿真，確定了能達(dá)到足夠均勻度的LED陣列圖案，光照系統(tǒng)可以在其工作范圍內(nèi)(距離光源25 cm，直徑20 cm的矩形平面)提供90%的均勻度。本次實(shí)驗(yàn)采用的光照系統(tǒng)如圖1(a)所示，LED光源的峰值波長(zhǎng)為630 nm，光源光功率分布圖如圖1(b)所示。

圖1 LED光照系統(tǒng)Fig.1 LED lighting system

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)根據(jù)光照強(qiáng)度不同和細(xì)胞是否加脂多糖刺激分為6個(gè)小組，分別為：1)對(duì)照組，細(xì)胞不受脂多糖刺激，也不受紅光照射；2)脂多糖(LPS)組，細(xì)胞受脂多糖刺激，但不受紅光照射；3)2 mW/cm2組，細(xì)胞受脂多糖刺激，同時(shí)受光劑量為18 J/cm2、光強(qiáng)為2 mW/cm2的紅光照射；4)5 mW/cm2組，細(xì)胞受脂多糖刺激，同時(shí)受光劑量為18 J/cm2、光強(qiáng)為5 mW/cm2的紅光照射；5)10 mW/cm2組，細(xì)胞受脂多糖刺激，同時(shí)受光劑量為18 J/cm2、光強(qiáng)為10 mW/cm2的紅光照射；6)20 mW/cm2組，細(xì)胞受脂多糖刺激，同時(shí)受光劑量為18 J/cm2、光強(qiáng)為20 mW/cm2的紅光照射。

實(shí)驗(yàn)流程：1)將鋪好細(xì)胞的96孔板放置在37 ℃、5% CO2、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)24 h后，吸除孔中舊培養(yǎng)基，往脂多糖組、4個(gè)光照組分別加入150 μL含有濃度為16 μg/mL脂多糖(Invivogen，美國(guó))的新鮮培養(yǎng)基，往空白對(duì)照組加入150 μL不含有脂多糖的新鮮培養(yǎng)基，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱；3)調(diào)好光照培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度，將需要光照的96孔板放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行光照，光照完后立刻放回細(xì)胞培養(yǎng)箱；4)24 h后，開始檢測(cè)細(xì)胞活性、活性氧、線粒體膜電位、上清液中PGE2的濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇：取在-80 ℃冰箱中凍存的牙齦成纖維細(xì)胞，于37 ℃水浴中迅速解凍，然后用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，放入離心機(jī)(L2-6K，可成)以1 000 R/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，移除上清液，用含10%胎牛血清(Gibco，美國(guó))和1%雙抗(HyClone，美國(guó))的MEM(1X)培養(yǎng)基(Gibco，meiguo1)進(jìn)行重懸，然后培養(yǎng)在25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并放入5% CO2、37 ℃、90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱(啟前QQ-80A-II，中國(guó))中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：待在熒光顯微鏡(Olympus BX53，日本)下觀察到貼壁細(xì)胞融合至80%左右開始進(jìn)行細(xì)胞傳代，去除舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS緩沖液(Solarbio，中國(guó))沖洗兩遍，然后用2 mL胰蛋白酶(Gibco，美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化至脫落，然后加入4 mL培養(yǎng)基終止消化，放入離心機(jī)以1 000 R/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，加入1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行吹打重懸，然后按1∶3的比例將細(xì)胞鋪至新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

細(xì)胞鋪板：等新培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞融合至80%左右，去除舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗兩遍，再用2 mL胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化至脫落，然后加入4 mL培養(yǎng)基終止消化，放入離心機(jī)以1 000 R/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，加入1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行吹打重懸，然后按照30 μL細(xì)胞重懸液與1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基的比例進(jìn)行細(xì)胞稀釋，再用排槍往96孔板中接種150 μL的稀釋好的細(xì)胞重懸液，使每個(gè)孔中的細(xì)胞密度適中、分布均勻，然后將鋪好細(xì)胞的96孔板放入細(xì)胞培育箱中，準(zhǔn)備下一步光照實(shí)驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)條件和分組

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性

從37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，使用排槍將舊培養(yǎng)基移除，然后每個(gè)孔中加入110 μL現(xiàn)配的含CCK-8(Dojindo，日本)的培養(yǎng)基(CCK-8與培養(yǎng)基的比例為1∶10)，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，最后用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，美國(guó))測(cè)定各個(gè)孔在450 nm處的吸光度，即可得出該孔的細(xì)胞活性。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

使用DCFH-DA探針(南京建成，中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧，將DCFH-DA探針按照1∶2000的比例加入無(wú)血清培養(yǎng)液中，然后往96孔板的每個(gè)孔中加入100 μL稀釋好的DCFH-DA，將96孔板放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育45 min后，吸除上清液，并用無(wú)血清培養(yǎng)液清洗兩次，并放置于發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm的熒光顯微鏡下觀察，拍好圖片，使用ImagJ軟件進(jìn)行分析。

1.6 線粒體膜電位檢測(cè)

使用帶有JC-1熒光探針(碧云天，中國(guó))的試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位，吸除96孔板的小孔中的舊培養(yǎng)基，往每個(gè)孔中加入100 μL的JC-1染色工作液，并放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min，孵育結(jié)束后，吸出上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，并放置于發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm和580 nm的熒光顯微鏡下觀察。

1.7 PGE2檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞上清液中前列腺素E2的濃度，使用酶聯(lián)免疫試劑盒(R&D System，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，用PGE2抗原包被在酶標(biāo)板上，使牙齦成纖維細(xì)胞上清液中的PGE2與包被的PGE2競(jìng)爭(zhēng)生物素標(biāo)記的抗PGE2單抗上的結(jié)合位點(diǎn)，使游離的成分被洗去；然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，使游離的成分被洗去，然后加入底物溶液，底物溶液在辣根過(guò)氧化物酶的催化下會(huì)變成藍(lán)色，加入終止溶液后變成黃色，用酶標(biāo)儀在發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)OD值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出牙齦成纖維細(xì)胞上清液中的PGE2濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均需重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS進(jìn)行方差分析(ANOVA),若P<0.05，則表示有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 脂多糖對(duì)細(xì)胞活性的影響

脂多糖(LPS)是牙齦卟啉單胞菌外膜的主要成分，在本實(shí)驗(yàn)中被用來(lái)刺激牙齦成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。Sismey-Durrant等在含0.1、1.0和10.0 μg/mL牙齦卟啉單胞菌脂多糖的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS濃度越高，細(xì)胞產(chǎn)生的PGE2水平越高[12]。荊冉等發(fā)現(xiàn)1 μg/mL的脂多糖對(duì)人周膜成纖維細(xì)胞活性的抑制效果不明顯 (P>0.05)，但10 μg/mL的脂多糖可以顯著的抑制細(xì)胞活性(P<0.05)[13]。為防止LPS濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，對(duì)細(xì)胞造成損傷，所以先探究不同濃度的脂多糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞活性的影響。先配好含有濃度分別為0、4、8、16、32、64、128 μg/mL脂多糖的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)基分別加入到含有牙齦成纖維細(xì)胞的96孔板中，再把96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，最后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)在含有不同濃度脂多糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞活性。從圖2中我們可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中的脂多糖濃度小于16 μg/mL時(shí)，脂多糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的活性影響較小，4、8、16 μg/mL組的牙齦成纖維細(xì)胞活性與對(duì)照組(0 μg/mL)的細(xì)胞活性沒(méi)有顯著性差異；當(dāng)培養(yǎng)基中脂多糖濃度在32 μg/mL以上時(shí)，脂多糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞活性的影響較大，32、64、128 μg/mL組的牙齦成纖維細(xì)胞活性與對(duì)照組(0 μg/mL)的細(xì)胞活性之間有顯著性差異。所以，我們選擇16 μg/mL的脂多糖濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度脂多糖對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞活性的影響(P<0.05)Fig.2 Effects of different concentrations of lipopolysaccharide on the activity of gingival fibroblasts

2.2 不同強(qiáng)度光照對(duì)細(xì)胞分泌PGE2的影響

PGE2是人體細(xì)胞中重要的炎癥介質(zhì)，在牙周病患者的唾液中的含量明顯高于正常人[14]。PGE2主要是由受到細(xì)菌分泌的脂多糖刺激后的牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，前列腺素E2濃度增加會(huì)引起牙齦炎和牙槽骨吸收[15，16]。在本實(shí)驗(yàn)中，使用濃度為16 μg/mL的牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激牙齦成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，然后對(duì)產(chǎn)生炎癥的細(xì)胞進(jìn)行光照處理，光照劑量均為18 J/cm2,根據(jù)光強(qiáng)度的不同，將實(shí)驗(yàn)組分為2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2，并設(shè)有control組(細(xì)胞不受脂多糖刺激，也進(jìn)行光照)和LPS組(細(xì)胞只受脂多糖刺激，不進(jìn)行光照)進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)圖3結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激下的牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了更多的PGE2，說(shuō)明脂多糖使細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的炎癥反應(yīng)；4個(gè)光照組相比于LPS組，PGE2的濃度顯著下降，說(shuō)明18 J/cm2的紅光照射可以抑制炎癥細(xì)胞分泌PGE2，即可以促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生抗炎反應(yīng)；5 mW/cm2組的PGE2濃度顯著低于2 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2組，說(shuō)明在光照劑量相同情況下，強(qiáng)度為5 mW/cm2的光對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞炎癥的治療效果最好。

圖3 不同光照強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞分泌PGE2的影響 (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.3 The effect of different light intensity on PGE2 secretion by cells

2.3 不同強(qiáng)度光照對(duì)細(xì)胞活性的影響

吳艷、Zaccara IM、Soares DM等發(fā)現(xiàn)一定能量的LED紅光照射可以使牙周膜干細(xì)胞、人牙髓干細(xì)胞、人牙周韌帶干細(xì)胞增殖[17-19]。前面，我們發(fā)現(xiàn)630 nm紅光照射可以抑制炎癥細(xì)胞內(nèi)PGE2的產(chǎn)生，使受LPS刺激后的牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥減輕，為了研究這是否與紅光可以促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)。接下來(lái)我們探究不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞活性的影響。首先將牙齦成纖維細(xì)胞均勻的鋪在96孔板內(nèi)，然后將細(xì)胞分成6組，按相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件處理細(xì)胞，將所有處理后的細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，24 h后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞的活性。如圖4所示，6個(gè)組的細(xì)胞活性之間沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)中光照條件和脂多糖處理均對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的活性沒(méi)有明顯影響，也證明了紅光照射抑制細(xì)胞炎癥與改變細(xì)胞活性無(wú)關(guān)。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞活性Fig.4 The cell viability under different experimental conditions

2.4 不同強(qiáng)度光照對(duì)細(xì)胞ROS水平的影響

Orihuela-Campos等[20]、Tsutsumi等[21]、李坤陽(yáng)等[22]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、L-抗壞血酸2-磷酸鎂鹽、姜黃素等作用于人牙齦成纖維細(xì)胞，能夠有效抑制ROS產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但很少有人研究LED紅光對(duì)炎癥細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。因此，我們探究在相同光劑量18 J/cm2，不同光照條件下，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖5(a)為熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)活性氧的熒光圖，圖5(b)為使用ImagJ軟件對(duì)熒光圖進(jìn)行分析的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)16 μg/mL的脂多糖刺激牙齦成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平上升，這與李瑩等[23]、吳忠敏等[24]的研究結(jié)果一致。我們還可以發(fā)現(xiàn)LED紅光照射可以抑制炎癥細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，LPS組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著高于2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，且當(dāng)光強(qiáng)為5 mW/cm2時(shí)，紅光照射對(duì)炎癥細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的抑制效果最佳，這與LED紅光抑制炎癥細(xì)胞內(nèi)PGE2的產(chǎn)生的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，也說(shuō)明LED紅光抑制細(xì)胞炎癥有可能是通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生傳導(dǎo)的，這與Lim等[25]所研究的結(jié)果與推論一致。

圖5 不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞內(nèi)ROS水平(*P<0.05, **P<0.01)Fig.5 IntracelluLar ROS levels under different experimental conditions

2.5 不同強(qiáng)度光照對(duì)細(xì)胞MMP的影響

線粒體是ROS生產(chǎn)的主要場(chǎng)所，特別是受損傷的線粒體會(huì)釋放出大量的ROS，高水平的ROS會(huì)損壞線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降[26]。正常線粒體膜電位是維持線粒體功能的前提，線粒體膜電位下降，會(huì)使線粒體功能障礙，這是細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)記性事件[27，28]。ROS是正常細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，而過(guò)量的ROS會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使牙齦成纖維細(xì)胞的線粒體膜電位下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。在本實(shí)驗(yàn)中，脂多糖刺激牙齦成纖維細(xì)胞，使牙齦成纖維細(xì)胞內(nèi)的ROS水平上升，LED紅光照射使炎癥細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降。為了探究炎癥細(xì)胞的線粒體膜電位是否受到影響從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，我們對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖6(a)所示，當(dāng)線粒體膜電位高時(shí)，JC-1主要以紅色熒光聚合物形式存在；當(dāng)線粒體膜電位低時(shí)，JC-1主要以綠色的熒光單體形式存在。圖6(b)是使用ImagJ軟件對(duì)線粒體膜電位熒光率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)受脂多糖和光照刺激的細(xì)胞線粒體膜電位相對(duì)于空白對(duì)照組沒(méi)有下降，線粒體功能正常，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志。這也可以說(shuō)明使用LED紅光照射可以抑制牙齦成纖維細(xì)胞炎癥，且不會(huì)導(dǎo)致牙齦成纖維細(xì)胞的線粒體膜電位下降，也不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

圖6 不同實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞線粒體膜電位Fig.6 Cell MMP under different experimental conditions

3 結(jié)論

我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了630 nm LED紅光照射可以抑制牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，波長(zhǎng)為630 nm、光劑量為18 J/cm2、不同光強(qiáng)度(2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2)的紅光LED照射均可以降低受脂多糖刺激而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的牙齦成纖維細(xì)胞上清液中PGE2的濃度；且在相同光照劑量條件下(18 J/cm2)，5 mW/cm2的紅光照射對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的炎癥抑制效果最佳。此外我們還發(fā)現(xiàn)紅光照射抑制牙齦成纖維細(xì)胞炎癥與降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)，與影響細(xì)胞活性無(wú)關(guān)；且LED紅光照射治療細(xì)胞炎癥的方法不會(huì)對(duì)細(xì)胞的線粒體膜電位造成影響，也不會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡。本文僅針對(duì)LED紅光對(duì)體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞抗炎反應(yīng)的研究得出初步結(jié)論，至于LED紅光是否可以在體外抑制口腔炎癥，還需進(jìn)一步的研究。