苧麻和大蒜FLOWERING LOCUS T基因家族比較和進化分析

高馨悅，嚴理，劉頭明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類生物學(xué)與加工重點實驗室，湖南 長沙 410205)

植物營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的過程稱作開花誘導(dǎo)，是高等植物生命周期中最重要的過程之一，這一過程受植物內(nèi)部多種基因和外部環(huán)境(如光照、溫度等)影響[1]。隨著近年來分子生物學(xué)的高速發(fā)展，在擬南芥和水稻等模式植物中，分離并鑒定出大量的開花相關(guān)基因。前人研究[2-3]明確了控制植物開花至少有6條主要途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、溫敏途徑、自主途徑和年齡依賴途徑。這些途徑對不同環(huán)境和植物體內(nèi)的各種因子產(chǎn)生反應(yīng)并轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的新信號，最后將新信號傳遞給開花整合因子，由其促進花分生組織特異基因的表達，誘導(dǎo)花的形成。FT(FLOWERING LOCUS T)是開花誘導(dǎo)過程中最重要的整合因子之一，在成花轉(zhuǎn)變中起著至關(guān)重要的作用，所有調(diào)控途徑幾乎都匯集于FT[4]。

FT基因能促進植物開花的功能最早是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的。經(jīng)前人研究，F(xiàn)T基因是在擬南芥葉片中被誘導(dǎo)表達，其蛋白質(zhì)由葉片經(jīng)過韌皮部移動到達莖頂端組織[5-7],在頂端分生組織中FT蛋白與FLOWERING LOCUS D (FD)和14-3-3蛋白互作并形成復(fù)合體，共同促進下游開花基因的表達，從而促進開花[8]。在水稻中，分離出的Hd3a基因編碼的蛋白與擬南芥的FT基因編碼的蛋白高度同源，同樣是在葉片中表達、合成并轉(zhuǎn)運到頂端分生組織，并于合適的光照條件下促進植株開花[6]。FT基因編碼的小分子蛋白為175個氨基酸，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyle-thanolamine-binding protein, PEBP)家族基因，哺乳動物中的PEBP蛋白能結(jié)合磷脂酰乙醇胺，植物中的PEBP磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白是植物生物膜結(jié)構(gòu)上的主要磷脂，發(fā)揮重要的蛋白質(zhì)識別和信號傳導(dǎo)作用[9]。

苧麻屬于短日照雙子葉植物，具有誘導(dǎo)成花的臨界日長和敏感期[10]。延遲苧麻開花，有利于延長其營養(yǎng)體生長時間，提高作物的纖維產(chǎn)量。而大蒜屬于長日照單子葉植物。苧麻基因組未發(fā)生近期的全基因組復(fù)制事件，因此其基因組較小(約270 Mb)(數(shù)據(jù)源于NCBI PRJNA663427)，而大蒜基因組近期發(fā)生了兩次全基因組復(fù)制事件，導(dǎo)致其基因組達到16.9 Gb[11]。由于大蒜在進化過程中發(fā)生了數(shù)次全基因組復(fù)制事件，使得大蒜基因家族擴張并出現(xiàn)基因冗余現(xiàn)象，致使大蒜FT基因家族中的基因數(shù)量增多。在前人對植物FT基因的研究中，多是用單子葉的水稻和雙子葉的擬南芥進行比較，少有研究將其他單、雙子葉植物的FT基因進行比較，因此，單、雙子葉FT之間的差異和聯(lián)系還存在一定空白。本研究中單子葉大蒜和雙子葉苧麻，該兩種植物中的FT家族基因在日前的研究中還鮮有報道，并且兩種植物中的FT進化機制當(dāng)前仍不清楚。因此，本研究以雙子葉植物苧麻和單子葉植物大蒜為對象，基于大蒜與苧麻中FT蛋白的同源性比較進一步分析，旨在為今后單、雙子葉的成花研究奠定一定基礎(chǔ)，為改良苧麻和大蒜這兩種經(jīng)濟作物的開花時間提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 苧麻和大蒜的基因篩選

以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞，對苧麻和大蒜的基因組注釋數(shù)據(jù)分別進行搜索。為保證搜索到的基因為苧麻和大蒜FT基因，將得到的基因所編碼的蛋白序列在NCBI的Conserved Domains(http:// www. Ncbi. nlm. nih. gov/ Structure/ cdd/ wrpsb. cgi)上完成保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，并將這些FT蛋白序列在NCBI中與其他物種FT蛋白進行比對，篩選出具有PEBP保守結(jié)構(gòu)域的苧麻和大蒜FT基因。

1.2 序列比對

收集擬南芥成花基因FT(AtFT)[12]和水稻中Hd3a[13]基因(見表1)。結(jié)合AtFT蛋白與Hd3a蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及本研究中篩選到的苧麻和大蒜中FT基因所編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用DNAMAN軟件進行蛋白多序列比對。最后采用MEGA 7.0軟件對AtFT/Hd3a蛋白和苧麻、大蒜中FT基因所編碼的全長氨基酸序列進行進化樹分析，分析模型采用Neighbor-Joining法，每個點計算1000次。

表1 苧麻和大蒜FT家族基因列表

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻和大蒜FT家族基因篩選

根據(jù)NCBI中公布的青葉苧麻[14]基因組(序列號：PRJNA663427)的注釋基因，以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞對基因組注釋進行搜索，得到2個注釋為“flowering locus T”的苧麻基因，這兩個基因編碼蛋白具有完整的PEBP結(jié)構(gòu)域序列，推測是全長cDNA。根據(jù)Sun等[11]完成的“二水早”大蒜基因組測序數(shù)據(jù)，以“flowering locus T”為關(guān)鍵詞對基因組基因注釋進行搜索，得到25個注釋為“flowering locus T”的大蒜基因，其中14個大蒜基因不具有完整的PEBP結(jié)構(gòu)域，故予以剔除。最后篩選到2個苧麻FT基因和11個大蒜FT基因，這些結(jié)果說明大蒜FT基因家族發(fā)生了顯著擴張。

2.2 FT蛋白序列比對

在擬南芥中，AtFT蛋白的功能主要是由其自身蛋白結(jié)構(gòu)特點決定的，其中大多數(shù)殘基的突變對其蛋白的開花調(diào)控功能影響不顯著。但是，其中5個殘基(Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140 和 Asn-152) 中的任意一個發(fā)生突變都可能導(dǎo)致其功能的完全改變[15-16]。為了研究苧麻和大蒜FT基因間的序列類似性，將已知模式植物擬南芥FT基因以及水稻Hd3a基因的編碼蛋白序列與本研究鑒定的2個苧麻FT基因和11個大蒜FT基因進行多蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對。從圖1可以看出，擬南芥FT和水稻Hd3a蛋白與雙子葉植物苧麻Bnt01G000036基因和Bnt02G002054基因編碼的氨基酸序列在Tyr-85、Glu- 109、Trp-138、Gln-140和Asn-152這5個關(guān)鍵氨基酸殘基處非常保守，而大蒜11個FT所編碼的蛋白中，只有4個FT蛋白(Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa7G06383.1和Asa7G06386.1)在這5處氨基酸殘基位點非常保守。Asa0G05138.1、Asa8G04470.1、Asa6G06199.1和Asa6G06200.1 4個蛋白都有一個關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變化，其中Asa0G05138.1和Asa8G04470.1是在152位的Ser發(fā)生變異，而Asa6G06199.1和Asa6G06200.1則在138位Val發(fā)生變異；Asa6G00188.1有兩個關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變異，分別為138位的Val和152位的Ser；Asa8G01025.1以及Asa8G01036.1與苧麻FT蛋白、AtFT和Hd3a等蛋白差異最大，只在第85位的關(guān)鍵氨基酸一致，其余4個關(guān)鍵氨基酸皆不同，分別變異為Val(第109位)、Val(第138位)、His(第140位)、Try(第152位)。

圖1 FT保守結(jié)構(gòu)域序列比對Fig.1 FT conserved domain sequence alignment

2.3 FT家族基因系統(tǒng)進化分析

為進一步分析苧麻和大蒜FT基因與AtFT/Hd3a基因之間的同源性，對這 15個FT同源蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果如圖2所示。15個FT蛋白被分為3類，其中苧麻蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054，大蒜蛋白Asa2G02821.1、Asa6G00732.1、Asa8G04470.1、Asa0G05138.1與AtFT/Hd3a蛋白同屬一類蛋白亞家族；大蒜蛋白Asa6G06199.1、Asa6G06200.1、Asa7G06383.1、Asa7G06386.1屬于第二類FT蛋白亞家族；而大蒜蛋白Asa6G00188.1、Asa8G01025.1和Asa8G01036.1則屬于第三類FT蛋白亞家族。由圖2可知，只有4個大蒜FT基因與苧麻FT基因歸于一類，其余7個大蒜基因又分成兩類。此外，深入分析第一個FT蛋白亞家族發(fā)現(xiàn)，苧麻FT同源蛋白Bnt01G000036、Bnt02G002054與擬南芥AtFT和水稻的Hd3a具有非常近的同源關(guān)系，而大蒜的4個FT同源蛋白進化關(guān)系相對較遠。其中，Bnt01G000036與AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分別為67.98%和69.44%，而Bnt02G002054與AtFT、Hd3a的蛋白序列一致性分別為76.70%和77.78%。這些研究結(jié)果說明苧麻FT同源蛋白在進化過程中非常保守，而大蒜FT同源蛋白在擴張后發(fā)生了大量變異。

圖2 FT蛋白序列進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of FT protein sequence

3 結(jié)論與討論

苧麻纖維是我國特色天然纖維，其從莖皮中剝?nèi)。瑢儆跔I養(yǎng)體纖維。苧麻莖葉中富含粗蛋白，也被廣泛用作飼草。較長的營養(yǎng)體生長周期有利于提高苧麻的纖維和嫩莖葉產(chǎn)量。苧麻對光周期敏感，短日照條件下苧麻易開花，從而降低營養(yǎng)體產(chǎn)量。因此，培養(yǎng)光周期鈍感的苧麻品種，延遲苧麻開花時間，是苧麻高產(chǎn)育種的重要目標，同時有助于實現(xiàn)苧麻產(chǎn)業(yè)向低緯度的東南亞地區(qū)轉(zhuǎn)移。FT基因是植物成花過程中重要的因子之一，F(xiàn)T功能和蛋白結(jié)構(gòu)在許多植物中高度保守。小麥[17]、大麥[18]、棉花[19]、豌豆[20]、黑麥草[21]等諸多植物中的FT蛋白在Tyr-85、Glu-109、Trp-138、Gln-140和Asn-152這5個關(guān)鍵氨基酸殘基位點皆與AtFT/Hd3a蛋白相一致，這些植物FT蛋白都與植物開花調(diào)控相關(guān)。本研究在苧麻中鑒定到兩個FT家族成員，其序列上都與AtFT/Hd3a高度同源。由此也可說明，苧麻中的FT基因家族在進化上是非常保守的，這為研究苧麻的開花進化機制奠定了基礎(chǔ)，而苧麻中成花素FT蛋白的鑒定也為開展苧麻的光鈍感品種選育提供了基因資源。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著大蒜基因組的擴張，大蒜FT家族基因數(shù)量也隨之發(fā)生了急劇擴張，家族成員達到了11個，家族成員過多可能會出現(xiàn)功能冗余。一般地，如果基因家族成員間功能冗余，當(dāng)某一成員發(fā)生突變，其功能可能會由其他成員予以補償，而導(dǎo)致個體性狀并未發(fā)生改變，進而將這種基因模式遺傳給后代，以維持物種在自然界中的穩(wěn)定。因此，推測這是大蒜FT家族成員廣泛擴張的一個可能原因。但由于成員之間蛋白序列發(fā)生了廣泛變異，也可能會導(dǎo)致部分基因功能分化。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T除了調(diào)控植物的開花，還能夠參與植物的其他發(fā)育過程，如塊莖形成、氣孔閉合和低溫響應(yīng)等[22]。在洋蔥和馬鈴薯的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T蛋白對于調(diào)控塊莖/鱗莖膨大具有非常關(guān)鍵的作用[23-24]。LEE等[24]發(fā)現(xiàn)洋蔥中有AcFT1-AcFT6共6類FT基因，AcFT1基因可以促進鱗莖形成，AcFT4基因抑制鱗莖的形成，AcFT2基因的表達與開花相關(guān)，而AcFT3、AcFT5和AcFT6基因作用還未被確定。大蒜與洋蔥同屬百合科蔥屬植物且FT家族基因在蛋白序列上都存在廣泛變異。因此，以洋蔥FT基因家族為參照，為今后研究FT家族基因在大蒜生長發(fā)育中的功能(尤其在開花調(diào)控、鱗莖形成中的功能)提供了一定的幫助。

在以往對短日照單子葉植物水稻和長日照雙子葉植物擬南芥的開花調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，兩者開花調(diào)控存在較大的相似性，同時又具有一定的差異[25]。本研究進一步分析了長日照單子葉植物大蒜和短日照雙子葉植物苧麻的成花素FT蛋白進化，研究結(jié)果進一步豐富了對植物開花進化機制的認識。