青海高原長(zhǎng)期復(fù)種綠肥毛葉苕子對(duì)土壤氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌的影響

韓 梅，高嵩娟，李正鵬，嚴(yán)清彪，曹衛(wèi)東

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所,青海 西寧 810016；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095)

綠肥在我國(guó)有著悠久的發(fā)展歷史，是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的精華，可以改善土壤有機(jī)質(zhì)，減少化肥的施用，增加土壤微生物的豐度和活性，對(duì)生態(tài)保護(hù)、可持續(xù)發(fā)展、糧食安全等具有重要意義。土壤微生物在土壤氮素轉(zhuǎn)化中占主導(dǎo)地位[1]。大量研究表明，種植翻壓綠肥可以增加土壤微生物的數(shù)量和多樣性，改變土壤微生物的組分和結(jié)構(gòu)[2-3]。微生物驅(qū)動(dòng)的氮循環(huán)主要包括硝化、反硝化、固氮和氨化[4]，其中硝化作用包括硝化和亞硝化作用兩個(gè)過程。在硝化微生物的作用下，有機(jī)物氨化后產(chǎn)生的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮。反硝化是一個(gè)微生物氧化還原過程，硝酸鹽和亞硝酸鹽逐漸轉(zhuǎn)化為氣態(tài)最終產(chǎn)物(NO, N2O和N2)[5]。農(nóng)田的氮循環(huán)過程涉及硝化作用[6]，氨氧化是硝化作用的第一步[7]。土壤氨氧化是土壤氮素循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是由各種氨氧化微生物驅(qū)動(dòng)完成。其中，氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)及多樣性是衡量土壤肥力和健康狀況的生物學(xué)指標(biāo)[8]。施肥引起的土壤中AOA和AOB的變化引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。AOA和AOBamoA基因的豐度經(jīng)常被用來評(píng)價(jià)不同土壤參數(shù)和管理方法對(duì)氨氧化微生物群落大小的影響。大量研究表明，氨氧化過程是由土壤AOA和AOB共同進(jìn)行的，不同施肥類型和施肥量對(duì)土壤AOB和AOA的影響不同。在自然生態(tài)系統(tǒng)中，AOA比AOB更為豐富[9-10]。

青海省地處高原冷涼地區(qū)，麥后復(fù)種綠肥對(duì)青海高原地區(qū)綠肥-小麥生產(chǎn)系統(tǒng)土壤AOB和AOA數(shù)量和群落組成的影響仍不清楚，亟待研究。系統(tǒng)研究復(fù)種綠肥，翻壓、留茬條件下土壤微生物的變化將有助于了解不同施肥模式下土壤培肥機(jī)制，掌握土壤氮素循環(huán)和轉(zhuǎn)化情況，對(duì)青海高原地區(qū)復(fù)種綠肥、減施化肥對(duì)土壤肥力的影響及生產(chǎn)綠肥有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品具有指導(dǎo)性意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于青海省西寧市城北區(qū)農(nóng)科院試驗(yàn)地，海拔為2 282 m，緯度101.75°，經(jīng)度36.72°。氣候冷涼，屬高原大陸性半干旱氣候。年平均氣溫5.9℃，作物生長(zhǎng)期為220.2 d。全年平均氣溫日較差為13.5℃，年平均降水量367.5 mm，年均蒸發(fā)量為1 729.8 mm。試驗(yàn)區(qū)主要水源為北川渠，灌溉條件較好。土壤類型為栗鈣土，前茬作物為油菜。

1.2 供試材料

供試綠肥為毛葉苕子，養(yǎng)分含量C 46.32%、N 2.45%、P 0.31%、K 1.82%；毛苕子根茬養(yǎng)分含量N 2.43%、P 0.78%、K 0.98%。供試小麥品種為青春38；供試肥料為尿素(含N46%)、過磷酸鈣(含P2O512%)。供試土壤為栗鈣土，土壤pH值為8.31，有機(jī)質(zhì)16.67 g·kg-1，全氮1.11 g·kg-1、全磷2.18 g·kg-1、全鉀26.33 g·kg-1、堿解氮98 mg·kg-1、有效磷13.1 mg·kg-1、速效鉀139 mg·kg-1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于青海省西寧市城北區(qū)農(nóng)科院試驗(yàn)地，是2010年布置的一個(gè)綠肥長(zhǎng)期定位試驗(yàn)。該試驗(yàn)采用青海省綠肥作物適種區(qū)主栽作物小麥、油菜輪作模式，2017年度以小麥為主作，試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理:100%化肥+綠肥根茬(F100+GR)；90%化肥+綠肥根茬(F90+GR)；80%化肥+綠肥根茬(F80+GR)；70%化肥+綠肥根茬(F70+GR)；60%化肥+綠肥根茬(F60+GR)；不施肥+綠肥根茬(F0+GR)；70%化肥+綠肥翻壓(F70+GT)；不施肥(F0)；100%化肥(F100)。其中100%化肥為N 225.0 kg·hm-2、P2O5112.5 kg·hm-2。 4次重復(fù)，小區(qū)面積20.0 m2(5.0 m×4.0 m)。

于2017年3月15日播種小麥，播量300 kg·hm-2，播種前將肥料均勻撒施，深翻。在7月下旬小麥?zhǔn)斋@后復(fù)種毛葉苕子，播量105.0 kg·hm-2，播種后灌水，10月中旬收獲，需壓青處理，將該區(qū)收獲的毛葉苕子鍘切成10 cm左右后進(jìn)行翻壓，毛葉苕子鮮草翻壓量為30 000 kg·hm-2。

1.4 樣品采集

在小麥播種期(3月15日)、抽穗期(6月8日)、成熟期(7月25日)采集5～20 cm土層土壤樣品。在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選擇3個(gè)樣點(diǎn)，均勻混合后保存于-80℃冰箱。

1.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.5.1 DNA 提取與標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 土壤DNA采用PowerSoil DNA提取試劑盒提取。每個(gè)樣品提取3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)由3份DNA混合而成。DNA質(zhì)量由NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值確定。

普通PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25μl，包括模板DNA0.5 μl，引物F(10μM)0.5 μl，引物 R (10 μM) 0.5 μl，dNTP (10 mM) 2.5 μl，Taq Buffer(10×)2 μl，MgCl2(25 mM)2 μl，Taq酶(5U·μl-1)0.2 μl，H2O18.3 μl。

氨氧化古菌(AOA)amoA基因引物Arch-amoAF(5′- STAATGGTCTGGCTTAGACG -3′)和Arch-amoAR(5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT- 3′)[11]。

氨氧化細(xì)菌(AOB)amoA基因引物amoA-1(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[12]。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s、72℃修復(fù)延伸8 min，共35個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)后通過割膠回收試劑盒純化目的條帶，TA克隆后進(jìn)行克隆質(zhì)粒的提取，提取過程參照生工質(zhì)粒提取試劑盒SK8191 SanPrep。提取質(zhì)粒后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒OD260值。通過公式換算成拷貝數(shù)(copies/μl)。

1.5.2 熒光定量PCR測(cè)定 通過熒光定量PCR儀(ABI7500)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，各基因引物均與普通PCR引物相同，反應(yīng)體系為10μl，包括SybrGreen qPCR Master Mix2X 5μl，引物F (10μM) 10μM 0.2μl，引物R (10μM) 10μM 0.2μl，ddH20 3.6μl，Template (DNA) 1.0μl，每10 μl體系加1 μl DNA模板。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s、57℃退火20 s、72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup(Roche 羅氏)中進(jìn)行反應(yīng)。

1.5.3 土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮測(cè)定 土壤微生物生物量碳(Soil microbial biomass carbon,SMBC)、土壤微生物生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen,SMBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法測(cè)定[13]。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并用SPSS 21.0(IBM SPSS Statistical 21, SPSS Inc. Chicago，Illinois)進(jìn)行方差分析和顯著性水平檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)種綠肥毛葉苕子對(duì)后茬作物產(chǎn)量的影響

2012—2019年油菜收獲后復(fù)種綠肥減施化肥定位試驗(yàn)表明，處理F70+GT(翻壓)產(chǎn)量最高，其次是處理F100+GR(留根茬),次之是處理F90+GR(留根茬)，高于單施化肥處理 5.05%～13.47%。在綠肥留根茬條件下，處理F100+GR(留根茬)比處理F100產(chǎn)量提高9.70%，處理F0+GR(留根茬)比處理F0產(chǎn)量提高7.56%，說明綠肥留根茬比不種綠肥增產(chǎn)效果好；在施70%化肥條件下，處理F70+GT(翻壓)比F70+GR(留根茬)處理產(chǎn)量高，增產(chǎn)16.33%，說明翻壓綠肥處理比綠肥留茬處理效果好；處理F70+GT(翻壓)比100%化肥產(chǎn)量增加10.00%，處理F80+GR(留根茬)與100%化肥產(chǎn)量相當(dāng)，也就是說翻壓綠肥可減施化肥30%，綠肥留根茬可減施化肥20%，且油菜表現(xiàn)為增產(chǎn)(表1)。

表1 綠肥不同利用模式下后茬作物油菜產(chǎn)量的響應(yīng)/(kg·hm-2)

復(fù)種綠肥，后茬作物小麥產(chǎn)量結(jié)果表明(表2)，處理F70+GT(翻壓)產(chǎn)量最高，其次是處理F100+GR(留根茬),次之是處理F90+GR(留根茬),與油菜復(fù)種綠肥產(chǎn)量增產(chǎn)趨勢(shì)相似。在綠肥留根茬條件下，處理F100+GR(留根茬)比處理F100產(chǎn)量提高10.12%，處理F0+GR(留根茬)比處理F0產(chǎn)量提高13.95%，說明綠肥留根茬比不種綠肥增產(chǎn)效果好；在施70%化肥條件下，處理F70+GT(翻壓)比F70+GR(留根茬)處理產(chǎn)量高，增產(chǎn)15.93%，說明翻壓綠肥處理比綠肥留茬處理效果好；處理F70+GT(翻壓)比100%化肥產(chǎn)量增加10.43%，處理F80+GR(留根茬)與100%化肥產(chǎn)量相當(dāng)，也就是說翻壓綠肥可減施化肥30%，綠肥留根茬可減施化肥20%。

表2 綠肥不同利用模式下后茬作物小麥產(chǎn)量的響應(yīng)/(kg·hm-2)

2.2 復(fù)種綠肥毛葉苕子對(duì)土壤理化性質(zhì)及土壤微生物生物量碳氮的影響

長(zhǎng)期單施化肥處理的土壤全氮、堿解氮、有機(jī)質(zhì)、SMBC、SMBN含量與不施肥處理相比均略有增加(表3)，而在施用化肥基礎(chǔ)上配施綠肥毛葉苕子，處理F100+GR、F90+GR、F80+GR、F70+GR、F60+GR、F70+GT土壤有機(jī)質(zhì)、SMBC、SMBN均顯著提高(P<0.01)，其中處理F70+GT土壤全氮、有機(jī)質(zhì)、SMBC、SMBN為最高，比其他處理分別提高1.32%～13.90%，2.09%～13.28%，9.54%～35.77%，1.26%～26.33%。綠肥全量翻壓處理(F70+GT)比根茬還田處理(F70+GR)土壤全氮、堿解氮、有機(jī)質(zhì)、SMBC、SMBN含量增加明顯，分別提高11.26%、0.10%、4.46%、9.62%、1.26%；綠肥配施化肥處理(F100+GR)比單施化肥處理(F100)土壤有機(jī)質(zhì)、SMBC、SMBN含量增加明顯，分別提高1.32%、11.13%、12.12%。

表3 不同施肥處理對(duì)土壤全氮、微生物生物量碳、微生物生物量氮的影響

2.3 復(fù)種綠肥減施化肥對(duì)氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)豐度的影響

以amoA基因?yàn)榘袠?biāo)，用熒光定量 PCR測(cè)定土壤AOA 數(shù)量，結(jié)果顯示，不同處理AOA 平均數(shù)量為1.24×105～7.51×106拷貝數(shù)·g-1干土，其中F70+GT、F70+GR、F100+GR處理 AOA 數(shù)量顯著高于其他6個(gè)處理(P<0.05)(圖1)。在整個(gè)小麥生長(zhǎng)周期內(nèi)，土壤AOA 數(shù)量基本呈現(xiàn)先增加后減少趨勢(shì)。小麥播種期土壤AOA 數(shù)量較低，為1.24×106～3.42×106拷貝數(shù)·g-1干土，至抽穗期土壤AOA 數(shù)量達(dá)到最高，變化幅度為3.24×106～7.51×106拷貝數(shù)·g-1干土，成熟期降到最低，為1.56×106～3.17×106拷貝數(shù)·g-1干土。

不同施肥處理下土壤氨氧化古菌(AOA)amoA基因的數(shù)量均明顯高于氨氧化細(xì)菌(AOB)，化肥配施毛葉苕子土壤氨氧化古菌(AOA)、氨氧化細(xì)菌(AOB)數(shù)量明顯高于單施化肥和不施肥處理。綠肥不論全翻壓還是留根茬與化肥配施土壤氨氧化古菌(AOA)、氨氧化細(xì)菌(AOB)數(shù)量均有增加(圖1、圖2)。結(jié)果表明，AOA 是參與土壤環(huán)境中氨氧化過程的重要微生物，復(fù)種綠肥則增加了AOA、AOB數(shù)量，尤其是AOA數(shù)量增加明顯，增加幅度為54.84%～72.51%。

圖2 不同施肥處理土壤微生物AOB的響應(yīng)Fig.2 Effects of different fertilization treatments on AOB

處理F70+GT與處理F70+GR相比較，綠肥全量翻壓土壤微生物AOB拷貝數(shù)含量播種期、抽穗期顯著高于根茬還田處理(P<0.01)，成熟期也有所提高；處理F100與處理F100+GR相比較，綠肥配施化肥處理比單施化肥處理土壤AOB拷貝數(shù)含量增加更明顯；根茬各處理相比，其中處理F70+GR、F80+GR土壤AOB拷貝數(shù)含量較高。

2.4 氨氧化古菌與氨氧化細(xì)菌基因拷貝數(shù)的比值分析

氨氧化古菌與氨氧化細(xì)菌amoA基因的AOA/AOB比值被認(rèn)為是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)的潛在微生物指標(biāo)[14]。土壤 AOA/AOB 數(shù)值在3.09～155.43(表4)，說明土壤硝化過程主要受 AOA 影響?？瞻讓?duì)照F0與其他處理相比，施肥顯著降低了各處理中AOA/AOB比值。處理F100+GR和F100相比，復(fù)種綠肥明顯增加了AOA/AOB比值。

表4 氨氧化古菌與氨氧化細(xì)菌amoA基因拷貝數(shù)的比值

2.5 復(fù)種綠肥條件下氮轉(zhuǎn)化功能基因與環(huán)境變量間相關(guān)關(guān)系

對(duì)土壤全氮(TN)、堿解氮(AN)、有機(jī)質(zhì)(SOM)、微生物生物量碳(SMBC)、微生物生物量氮(SMBN)、氨氧化古菌(AOA)及氨氧化細(xì)菌(AOB)之間相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，土壤SMBC與SMBN、SOM與SMBC呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其余相關(guān)性不顯著(表5)。

表5 氮轉(zhuǎn)化功能基因與環(huán)境變量間的相關(guān)性

3 討 論

3.1 長(zhǎng)期復(fù)種綠肥可增加產(chǎn)量、減少化肥施用量

大量研究表明，輪作、復(fù)種可以提高作物產(chǎn)量，是種養(yǎng)結(jié)合的一項(xiàng)重要農(nóng)業(yè)技術(shù)措施，增產(chǎn)幅度在10%～20%。本試驗(yàn)研究表明，長(zhǎng)期麥后復(fù)種翻壓綠肥可減施化肥30%，綠肥留根茬可減施化肥20%，且小麥、油菜增產(chǎn)。后茬作物小麥生育期施氮量減少 20%～30%時(shí)(157.5～180 kg·hm-2)與正常供氮水平(225 kg·hm-2)相比，產(chǎn)量不但沒有降低,而且增加。說明復(fù)種豆科綠肥后，顯著增加了土壤的氮庫,有效減少了化肥氮的施用量。與單施化肥處理相比，復(fù)種綠肥處理提高了小麥氮肥利用率。這與李雙來等[15]、袁家富等[16]的研究結(jié)果一致。

3.2 長(zhǎng)期復(fù)種綠肥改變土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細(xì)菌(AOB)的數(shù)量

土壤AOB和AOA數(shù)量受氮的有效性[17]、溫度[18]、土壤pH值[19]、土壤含水量[20]和施肥措施[21]等因素影響。有研究表明，在不同耕作制度和施肥條件下，旱地向水田轉(zhuǎn)化后，AOA豐度增加，AOB豐度降低[22]，長(zhǎng)期施用有機(jī)肥提高了稻田土壤AOB豐度[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，綠肥不論全量翻壓還是留根茬，與化肥配施土壤AOA、AOB數(shù)量均有增加，尤其是AOA在數(shù)量上遠(yuǎn)高于AOB。這與Leininger等[24]報(bào)道的原始土壤和農(nóng)業(yè)土壤中AOA在數(shù)量上遠(yuǎn)高于AOB結(jié)果一致，本次試驗(yàn)再次證實(shí)了參與土壤環(huán)境中氨氧化過程的重要微生物是AOA。在整個(gè)小麥生長(zhǎng)周期內(nèi)，抽穗期土壤AOA、AOB數(shù)量達(dá)到最高,成熟期較低。這與水稻成熟期土壤AOA、AOB豐度均明顯高于分蘗期和孕穗期結(jié)果不一致[25]。這可能是由于試驗(yàn)生態(tài)環(huán)境不同，與土壤水分、綠肥熟解速度、微生物變化等有關(guān)，需進(jìn)一步深入研究青海高原旱地長(zhǎng)期復(fù)種綠肥條件下土壤反硝化作用的變化情況。針對(duì)高原地區(qū)旱地AOA和AOB的研究報(bào)道相對(duì)較少，需要做更多的相關(guān)研究工作來驗(yàn)證有關(guān)科學(xué)問題。

3.3 長(zhǎng)期麥后復(fù)種綠肥改變土壤微生物生物量碳、氮特征

30 a長(zhǎng)期施用有機(jī)肥研究表明，與常規(guī)肥料相比，有機(jī)肥的施用增加了土壤有機(jī)質(zhì)和微生物生物量碳[26-27]。復(fù)種綠肥毛葉苕子，較單施化肥提高了土壤SMBC、SMBN含量。這與研究結(jié)果綠肥與化肥配施顯著提高土壤SMBN含量相一致[28]。全量翻壓綠肥毛葉苕子、留根茬處理增加了微生物群落物種數(shù)量、優(yōu)勢(shì)種的優(yōu)勢(shì)度,這可能是由于綠肥的C/N有利于土壤微生物的生長(zhǎng)，綠肥為微生物提供了較多的能源與養(yǎng)分，促進(jìn)土壤微生物大量繁殖，加快微生物的新陳代謝[29]，從而提高了土壤SMBC、SMBN含量，改善了土壤理化性質(zhì)，也是造成土壤中AOA、AOB數(shù)量變化的主要原因[30-31]。復(fù)種綠肥毛葉苕子顯著增加了土壤全氮、SMBC與SMBN含量，為AOA提供了足夠的碳源和能源，促進(jìn)了AOA數(shù)量的增加，且AOA拷貝數(shù)與土壤SMBC、SMBN呈顯著正相關(guān)關(guān)系，表明土壤SMBC、SMBN影響土壤AOA數(shù)量的變化。

4 結(jié) 論

在青海高原，長(zhǎng)期種植翻壓綠肥可減施化肥30%，綠肥留根茬可減施化肥20%，且小麥、油菜增產(chǎn)。長(zhǎng)期種植綠肥顯著改變了青海高原地區(qū)土壤AOA 、AOB數(shù)量及微生物量，進(jìn)而影響土壤質(zhì)量?；屎途G肥配施的處理產(chǎn)量和生態(tài)效益要明顯高于長(zhǎng)期單獨(dú)施用化肥或單施綠肥。本研究結(jié)果表明，綠肥不論全量翻壓還是留根茬，與化肥配施產(chǎn)量增加、土壤AOA、AOB數(shù)量均有增加，尤其是AOA在數(shù)量上遠(yuǎn)高于AOB，表明不同土壤微生物豐度受種植模式、施肥量影響很大。研究不同綠肥利用模式、施肥量對(duì)土壤AOA、AOB數(shù)量的影響，有助于了解綠肥培肥土壤的機(jī)制，掌握土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，將為青海高原農(nóng)田土壤合理施肥提供科學(xué)依據(jù)。