外源褪黑素和脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗生理特性的影響

劉芯伶,彭玉婷,王云梅,夏 惠,梁 東，胡容平

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 四川 成都 611130;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066)

近年來(lái)隨著全球氣溫變暖及降水量在時(shí)空分布上不均衡的加劇，干旱已成為影響全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要非生物因素[1-2]。獼猴桃為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(ActinidiaLindl.)，與其他果樹相比，獼猴桃葉片大而薄，葉背被毛，莖具髓心，根為肉質(zhì)淺根，這些形態(tài)結(jié)構(gòu)特征使其對(duì)水分脅迫較為敏感[3]。土壤干旱常常會(huì)使獼猴桃根系受損，導(dǎo)致其生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)造成果實(shí)綜合品質(zhì)的下降，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)引起葉片的大面積焦枯脫落，甚至導(dǎo)致樹體死亡，給農(nóng)戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，提高獼猴桃抗旱性，已成為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的主要問題之一。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是一類少量存在于植物體內(nèi)，但對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著重要作用的小分子物質(zhì)，包括生長(zhǎng)素、褪黑素、脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯等。近年研究發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在提高植物的抗逆性方面也起著積極的調(diào)節(jié)作用[4]。褪黑素(melatonin，MT)是一種新型植物激素，廣泛存在于植物體內(nèi)，具有吲哚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)，可作為抗氧化劑和信號(hào)分子在提高植物對(duì)冷害[5]、干旱[6]、鹽脅迫[7]及重金屬脅迫[8]等非生物逆境的抗逆性方面起著積極作用。脫落酸(abscisic acid，ABA)對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、抗逆性、氣孔運(yùn)動(dòng)和基因表達(dá)等都有重要調(diào)節(jié)功能[9-10]，在植物響應(yīng)干旱脅迫的ABA依賴途徑中起著信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵作用[11]。

多見單獨(dú)施用MT或ABA提高植物耐旱性的相關(guān)研究報(bào)道，但關(guān)于兩者混合施用對(duì)植物干旱脅迫的效果及其生理機(jī)理的研究還比較少。本試驗(yàn)通過(guò)單一或混合施用MT和ABA的試驗(yàn)，綜合分析生長(zhǎng)指標(biāo)、光合特性及抗氧化酶活性等的變化，探究混合施用MT和ABA對(duì)干旱脅迫的效果及其作用的生理機(jī)制，以期為其在獼猴桃生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)，為二者在其他果樹上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為盆栽獼猴桃實(shí)生苗。于2019年1月選取‘金實(shí)1號(hào)’的飽滿種子4℃層積，2個(gè)月后進(jìn)行4℃、12 h與25℃、12 h交替的變溫催芽處理。待種子露白后播入穴盤(基質(zhì)為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1)，放于溫度為25℃±2℃、光強(qiáng)為4 860 μmol ·m-2·s-1(12 h/12 h)的培養(yǎng)室中生長(zhǎng)。待第1片真葉展開后，開始澆1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每周澆一次，其間補(bǔ)充清水。

1.2 試驗(yàn)處理

6月中旬，幼苗長(zhǎng)至6片真葉，將其移至營(yíng)養(yǎng)缽(20 cm×20 cm)中，基質(zhì)為草炭土∶椰殼∶珍珠巖=2∶2∶1，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽植入3株幼苗，轉(zhuǎn)移到室外避雨棚內(nèi)，常規(guī)管理。2周后待幼苗適應(yīng)遮雨棚環(huán)境，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的實(shí)生苗90盆，平均分為5組進(jìn)行處理：對(duì)照組(CK)、干旱處理組(DCK)、褪黑素處理組(MT+D)、脫落酸處理組(ABA+D)、褪黑素和脫落酸處理組(MT+ABA+D)。重復(fù)3次，每重復(fù)6盆。干旱處理前，對(duì)MT+D處理和MT+ABA+D處理用100 μmol·L-1褪黑素溶液進(jìn)行根灌，每2 d 1次，共4次，每次200 mL；其他處理根灌等量清水。第4次根灌褪黑素的次日(設(shè)為干旱處理0 d)，除CK組正常澆水外，其余處理均進(jìn)行干旱處理，控制澆水，于干旱的第0、2、4、6、8、10天，對(duì)脫落酸處理ABA+D和MT+ABA+D葉面噴施10 mL ABA溶液，濃度為25 μmol·L-1，其余處理組則葉面噴施等量清水。干旱處理的第20天采取各處理組植株從下往上數(shù)第4～8節(jié)位的葉片，用于相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

隨機(jī)選取每處理組中9株幼苗用于生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定，株高、根長(zhǎng)使用直尺測(cè)定，莖粗使用游標(biāo)卡尺測(cè)定莖基部直徑，干重取整株清洗后置于烘箱烘至恒重稱重；光合指標(biāo)使用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR Inc.，美國(guó))于晴天上午測(cè)定；葉綠素含量測(cè)定參照Z(yǔ)egaoui Z等[12]的方法；葉片相對(duì)含水量測(cè)定參照李合生等[13]的方法；葉片水勢(shì)使用葉片水勢(shì)儀(型號(hào)WP4C)測(cè)量；脯氨酸含量測(cè)定參照李合生等[12]的方法；可溶性蛋白含量采用G-250染色法[12]測(cè)定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[12]測(cè)定；過(guò)氧化氫(H2O2)含量采用紫外分光光度計(jì)法[12]測(cè)定；相對(duì)電導(dǎo)率(REL)測(cè)定參照向地英等[14]的方法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[12]測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法[15]測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法[16]測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用比色法[15]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其統(tǒng)計(jì)分析與圖表繪制利用Excel 2010軟件進(jìn)行，顯著性分析則利用SPSS 20.0軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)法進(jìn)行LSD檢驗(yàn)(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

單一施用脫落酸(ABA)或混合施用褪黑素(MT)和ABA可在一定程度上緩解干旱脅迫對(duì)獼猴桃幼苗各生長(zhǎng)指標(biāo)產(chǎn)生的影響(表1)。ABA+D、MT+ABA+D處理組的鮮重分別較DCK處理組高66%和104%左右，差異顯著。MT+ABA+D處理組的干重較DCK處理組高110%左右，差異顯著。植株的根長(zhǎng)、莖粗、株高，單一或混合施用MT或ABA均未對(duì)其產(chǎn)生顯著影響。

表1 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗光合指標(biāo)的影響

干旱脅迫導(dǎo)致植物光合速率降低[17]，而單一或混合施用MT和ABA可一定程度上提高干旱脅迫下獼猴桃幼苗的凈光合速率。如表2所示，MT、MT+ABA處理組的凈光合速率分別較DCK處理組高36%和29%左右(p>0.05)，且ABA+D處理組的效果最佳，較DCK處理組高40%左右，差異顯著。氣孔導(dǎo)度、胞間CO2、蒸騰速率、水分利用率，單獨(dú)或混合施用MT或ABA均未對(duì)其產(chǎn)生顯著影響。

表2 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗光合指標(biāo)的影響

2.3 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片光合色素的影響

干旱脅迫下，植物葉片片層結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致葉綠素分解[18]，單一或混合施用MT和ABA可緩解干旱引發(fā)的葉綠素含量下降。如圖1A所示，ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉綠素a含量分別較DCK處理組高6%和18%左右(p>0.05)。如圖1B所示，ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉綠素b含量分別較DCK處理組高7%和18%左右(p>0.05)。如圖1C所示，MT+D和ABA+D處理組的總?cè)~綠素含量分別較DCK處理組高1%和7%左右(p>0.05)，MT+ABA+D處理組的效果最佳，較DCK處理組高20%左右，差異顯著。

圖1 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量的影響Fig.1 Effect of MT and ABA on chlorophyll a, chlorophyll b, and total chlorophyllcontent in kiwifruit seedlings under drought stress

2.4 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對(duì)含水量和水勢(shì)的影響

植物葉片含水量能較好地指示植物對(duì)干旱脅迫的敏感性和耐受性[19-20]，而葉片水勢(shì)可指示葉片吸水和保水的能力，是反映體內(nèi)細(xì)胞水分狀況的重要生理指標(biāo)。葉片水勢(shì)參與細(xì)胞氣孔的調(diào)節(jié)，干旱脅迫下葉片水勢(shì)降低，氣孔關(guān)閉，水分散失減少[21]。如表3所示，MT或MT和ABA的施用可以提高葉片相對(duì)含水量和葉片水勢(shì)，增加植物對(duì)干旱的耐受性。MT+D和MT+ABA+D處理組葉片相對(duì)含水量分別較DCK組高9%和4%左右(p>0.05)。MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的葉片水勢(shì)分別較DCK處理組高39%、35%、32%左右，差異顯著。

表3 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對(duì)含水量、葉片水勢(shì)的影響

2.5 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖是植物體內(nèi)最主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，以降低細(xì)胞水勢(shì)，維持細(xì)胞吸水能力[22]。如圖2A所示，外源激素處理組中，MT+ABA+D處理組的脯氨酸含量最低，較MT+D處理組低78%左右(p>0.05)，較ABA+D處理組低126%左右，差異顯著。如圖2B所示，外源激素處理組中，MT+ABA+D處理組的可溶性蛋白含量最高，較MT+D處理組高10%左右(p>0.05)，較ABA+D處理組高3.5%左右(p>0.05)。如圖2C所示，外源激素處理組中，ABA+D處理組的可溶性糖含量最高，較MT+D處理組高70%左右，差異顯著，較ABA+D處理組高51%左右，差異顯著。

圖2 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響Fig.2 Effect of MT and ABA on the proline, soluble protein and soluble sugarcontent in kiwifruit seedling under drought stress

2.6 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片膜脂過(guò)氧化程度的影響

逆境會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的選擇透性降低或喪失，以致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲，引起葉片浸出液電導(dǎo)率變化，因此相對(duì)電導(dǎo)率可反映膜受傷害程度[23]。單一或混合施用MT或ABA可降低相對(duì)電導(dǎo)率，緩解干旱引發(fā)的細(xì)胞膜傷害。如圖3A所示，MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的相對(duì)電導(dǎo)率分別較DCK處理組低7%、8%、18%左右(p>0.05)。丙二醛含量可衡量脂質(zhì)氧化程度[24]，MT或MT和ABA的施用可降低幼苗葉片膜脂化程度，緩解干旱引發(fā)的細(xì)胞膜傷害。如圖3B所示，MT+D與MT+ABA+D處理組的MDA含量分別較DCK處理組低66%、44%左右，差異顯著。MT或ABA均可降低H2O2含量。如圖3C所示，MT+D、ABA+D和MT+ABA+D處理組的H2O2含量較DCK處理組低7%、13.5%、6.5%左右，差異顯著。

圖3 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛(MDA)和H2O2含量的影響Fig.3 Effects of MT and ABA on the relative electrolytic leakage, MDA and H2O2 contentin kiwifruit seedling leaves under drought stress

2.7褪黑素和脫落酸處理對(duì)干旱脅迫下獼猴桃葉片抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)3種抗氧化酶的主要功能是去除活性氧自由基并防止其過(guò)度積累[25]，單一或混合施用MT和ABA對(duì)這3種抗氧化酶的作用效果各不相同。如圖4A所示，MT+D處理組的SOD活性較DCK處理組高134%左右，差異顯著。如圖4B所示，MT+D處理組的POD活性較DCK處理組低12%左右，差異顯著，而ABA+D與MT+ABA+D處理組的POD活性則分別較DCK處理組高41%與35.5%左右，差異顯著。但MT、ABA及MT+ABA均未對(duì)CAT活性產(chǎn)生明顯影響(圖4C)。

圖4 褪黑素與脫落酸對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉片SOD、POD和CAT活性的影響Fig.4 Effect of MT and ABA on activity of SOD, POD and CATin kiwifruit seedling leaves under drought stress

3 討 論

土壤水分不足時(shí)，植物根系吸收的水分不足以彌補(bǔ)葉片蒸騰作用損失的水分，會(huì)導(dǎo)致葉片含水量降低，光合速率受限，生長(zhǎng)受阻。單獨(dú)或混合施用外源激素MT和ABA可一定程度提高干旱脅迫下植物的葉片水勢(shì)與凈光合速率，改善獼猴桃幼苗在干旱脅迫狀態(tài)下生長(zhǎng)的狀態(tài)。試驗(yàn)表明，單獨(dú)施用MT可提高干旱環(huán)境中獼猴桃的葉片水勢(shì)與葉片相對(duì)含水量，這在其他植物的相關(guān)研究中鮮見報(bào)道，但有研究表明ABA可增加植株在干旱條件下的保水能力[26]。本試驗(yàn)中ABA表現(xiàn)出了防止干旱脅迫下獼猴桃幼苗葉綠素分解，增加凈光合速率與干物質(zhì)積累的作用。值得注意的是，混合施用MT和ABA的作用與單獨(dú)施用ABA一致，但效果較單獨(dú)施用ABA顯著。推測(cè)，MT可激活A(yù)BA依賴型途徑中與保水相關(guān)的部分響應(yīng)元件來(lái)提高植物的葉片水勢(shì)與葉片相對(duì)含水量，而同時(shí)施用MT與ABA，會(huì)導(dǎo)致植物ABA依賴型途徑中與光合和生長(zhǎng)相關(guān)的響應(yīng)元件較單獨(dú)施用ABA被更多或更強(qiáng)烈地激活，從而使得通過(guò)ABA依賴型途徑完成的干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制的作用效果更佳，但此推論尚待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

研究表明，單獨(dú)施用外源MT和ABA可以提高植物的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[27-28]，該機(jī)制對(duì)植物適應(yīng)干旱環(huán)境下的水分脅迫，維持正常生長(zhǎng)與細(xì)胞吸水能力起到至關(guān)重要的作用[29-30]。試驗(yàn)表明，對(duì)處于干旱環(huán)境中的植物單獨(dú)施用ABA可使植株中的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量較CK組有所升高，而單獨(dú)施用MT僅使可溶性蛋白含量較CK組有所提高。值得注意的是，混合施用MT和ABA的作用效果與單獨(dú)施用MT相似，作用效果不如單獨(dú)施用ABA顯著。推測(cè)，MT介導(dǎo)可溶性蛋白這一滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)激活A(yù)BA依賴型途徑響應(yīng)元件，而同時(shí)施加MT與ABA，則降低了植物ABA依賴型途徑中與滲透相關(guān)的響應(yīng)元件對(duì)ABA的敏感度，這或與MT升高了葉片水勢(shì)與葉片相對(duì)含水量，減緩了干旱導(dǎo)致的獼猴桃滲透脅迫強(qiáng)度有關(guān)。

干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致植物活性氧自由基產(chǎn)生和清除的代謝平衡被破壞，引發(fā)或加劇細(xì)胞的膜脂過(guò)氧化，對(duì)植物細(xì)胞膜造成傷害[31-32]。本試驗(yàn)中，單獨(dú)施用MT可降低植株的MDA含量與H2O2含量，而單獨(dú)施用ABA則只降低H2O2含量。二者聯(lián)合施用時(shí)，作用效果與單獨(dú)施用MT時(shí)相似，這是由于MT除可通過(guò)ABA依賴型途徑降低細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度外，還可直接參與活性氧自由基的清除，故其保護(hù)細(xì)胞膜的作用更為強(qiáng)大。這也與王云梅等[33]研究得出的MT與ABA組合處理具有與MT處理類似的緩解氧化損傷的效果的結(jié)論相一致。

相關(guān)研究表明，單獨(dú)施用MT和ABA可以提高抗氧化相關(guān)酶SOD、POD與CAT活性，減緩膜脂過(guò)氧化帶來(lái)的傷害[27-28,33]。本試驗(yàn)中，單獨(dú)施用MT和ABA對(duì)SOD、POD活性的影響表現(xiàn)出了相反的作用，MT提高SOD活性，降低POD活性，而ABA則降低SOD活性，提高POD活性，但二者均未對(duì)CAT活性產(chǎn)生顯著影響。二者混合施用時(shí)的作用效果與單獨(dú)施用ABA類似。綜合來(lái)看，單一或混合施用MT和ABA對(duì)干旱脅迫下獼猴桃幼苗的抗氧化酶的活性變化的影響效果差異不大，SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶的活性始終處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)。

綜合來(lái)看，單獨(dú)施用MT利于增強(qiáng)干旱環(huán)境中獼猴桃的保水能力與抗氧化能力，關(guān)于MT提高植物抗氧化能力的報(bào)道較多，但關(guān)于其可提高保水能力的報(bào)道卻鮮見，有相關(guān)研究提及ABA可提高保水能力[26]。表明MT或可通過(guò)ABA依賴型途徑來(lái)增強(qiáng)植物的保水能力，這在前人相關(guān)研究中未見報(bào)道，其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。而混合施用MT和ABA的作用效果與單獨(dú)施用ABA的效果類似，主要通過(guò)改善光合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)干旱脅迫下的獼猴桃最優(yōu)生長(zhǎng)，這與王云梅等[33]在施用ABA濃度未表現(xiàn)出對(duì)葡萄干旱脅迫的緩解效果的情況下得出的 MT與ABA組合處理的效果與MT處理類似，主要通過(guò)緩解干旱引起的氧化損傷來(lái)提高抗旱性的結(jié)論不同，卻在一定程度上印證了MT可通過(guò)ABA依賴型途徑來(lái)完成干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制這一結(jié)論。MT與ABA兩者混合施用對(duì)植物脅迫的緩解效果及作用機(jī)理的研究鮮見報(bào)道，且大多與生理機(jī)制有關(guān)，并未深入到分子水平，MT與ABA組合處理的作用原理與機(jī)制仍存在大量空白，尚不清晰，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

褪黑素(MT)可使干旱脅迫下獼猴桃的葉片相對(duì)含水量、葉片水勢(shì)和SOD活性分別提高9%、39%和134%左右，而MDA與H2O2含量降低66%與7%左右。ABA可提高葉綠素含量、凈光合速率、干物質(zhì)積累和POD活性7%、40%、52%和41%左右，降低H2O2含量13.5%左右。MT+ABA處理的效果與ABA處理類似，可分別增加凈光合速率、干物質(zhì)的積累量與POD活性29%、110%與35.5%左右，降低MDA與H2O2含量44%、6.5%左右。表明MT利于提高植株的保水能力，降低膜脂過(guò)氧化程度。ABA和MT+ABA處理利于提高光合作用，使植株在水分限制條件下積累更多干物質(zhì)。