低溫脅迫下冬油菜隴油7號根部代謝組學分析

方 彥，曾秀存，馬 驪，孫柏林，武軍艷，董 云,3，劉麗君，金姣姣，孫萬倉，李學才

(1. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070; 2. 甘肅省油菜工程技術研究中心, 甘肅 蘭州 730070;3. 甘肅省農業(yè)科學院作物研究所, 甘肅 蘭州 730070 4. 河西學院農業(yè)與生物技術學院, 甘肅 張掖734000)

低溫逆境嚴重影響植物的生長和生產力。植物在一段時間的低溫鍛煉下可以獲得更高的抗凍能力[1]，在這一高度復雜的過程中，植物形態(tài)、分子、生化和生理均發(fā)生變化[2], 最終表現(xiàn)為與低溫脅迫相關的基因表達水平發(fā)生顯著變化，并重新調整代謝水平[3-4]。寒冷對植物的初生和次生代謝具有重要的調節(jié)作用[5]。植物在受到低溫等非生物脅迫之后，體內的代謝平衡被打破，為了抵御脅迫產生的傷害，植物通過信號轉導系統(tǒng)誘導合成抗逆相關的代謝產物，以修復損傷或達到新的代謝平衡[6]。在外界環(huán)境發(fā)生變化時，不同植物的代謝產物不同，同一植物不同器官或不同的發(fā)育時期代謝產物也有一定的差異。代謝物是基因型與表型之間的橋梁，代謝物的變化更能直接揭示基因的功能，因此能夠更有效地揭示生物學及其生化和分子機制。代謝組學已經被廣泛運用于逆境脅迫研究中[7-8]。擬南芥在冷脅迫應答過程中代謝組會發(fā)生明顯的變化[9]。低溫環(huán)境下的鼠耳芥屬植物的代謝指紋分析鑒定出了一系列已知和未知的與低溫相關的小分子代謝產物[10]。 Maruyama等[11]對擬南芥的冷處理材料利用液相色譜-離子阱質譜分析法檢測發(fā)現(xiàn)，次級代謝產物數(shù)量明顯下降，許多種單糖、二糖、三糖和糖醇會大量積累。Kaplan等[10]利用代謝組對擬南芥在低溫馴化下代謝變化進行分析，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫誘發(fā)廣泛的代謝響應。 此外，研究還發(fā)現(xiàn)抗寒能力不同的兩種基因型水稻在冷脅迫下可溶性糖類的積累是不同的[12]。

北方旱寒區(qū)冬油菜秋季播種，次年春季返青，冬季極端低溫限制了不同抗寒性冬油菜能否安全越冬。因此，強抗寒性是其適應北方寒冷環(huán)境而生存的前提。本課題組對低溫脅迫下隴油7號的形態(tài)特征[13]、生理生化[14]、抗寒響應的相關基因[15]和蛋白質組學[16]等進行了研究，但對冬油菜通過自身代謝調控來緩解傷害適應脅迫的系統(tǒng)研究還少見報道。在植物細胞中，許多代謝中間產物是調節(jié)細胞滲透勢的重要組分，而這些代謝物質含量的變化可能在植物代謝與生理反應中起十分重要的作用。通過廣泛靶向代謝組分析可以對特定的生理、生長發(fā)育等表型中時序表達差異積累的代謝物信息進行分析。根是北方旱寒區(qū)冬油菜越冬期唯一存活的器官，根部抵御低溫能力的強弱是決定冬油菜能否安全越冬的關鍵。因此，本試驗選擇超強抗寒白菜型冬油菜品種隴油7號為材料，對低溫脅迫下根部進行非靶向代謝組分析，為深入探討其越冬期的代謝變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

超強抗寒性白菜型冬油菜品種隴油7號種子由甘肅省油菜工程技術研究中心提供。將種子播于營養(yǎng)缽培養(yǎng)，每缽留苗4株，待幼苗長至 5～6片真葉進行處理。一組放入22℃培養(yǎng)箱(12 h光照/12 h 黑暗)平衡48 h后取根(CK)；為適應零度以下低溫處理，另一組降溫至4℃和0℃分別保持48 h(降溫速率2℃·h-1)，最后，以同樣的降溫速率降溫至-4℃保持 6 h(CT)，取根，液氮速凍后置于-80℃冰箱備用。每份樣品由在相同生長條件下的6株油菜組成，代謝組分析6個生物學重復。

1.2 實驗儀器與試劑

1290超高壓液相色譜儀(Agilent，美國)、 Triple TOF 5600高分辨質譜儀(AB Sciex，美國)；ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱 (美國，Waters，1.7 μm × 2.1 mm×100 mm)；PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)，甲醇、乙腈、醋酸銨和氨水均為德國CNW公司LC-MS級。

1.3 代謝物提取

樣品放入預冷的研缽中，加液氮研磨至粉末狀。稱取50 mg粉末樣品置于2 mL EP管中，加入1 000 μL提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1)，再加入20 μL 內標L-2-氯苯丙氨酸，渦旋混勻30 s；放入鋼珠，45 Hz研磨儀處理4 min，冰水浴超聲5 min(重復3遍)；-20℃靜置1 h；4℃，12 000 r·min-1離心15 min；移取600 μL上清液于EP管中，真空濃縮后加入200 μL 提取液(乙腈∶水=1∶1)復溶；渦旋30 s，冰水浴超聲10 min后將樣品4℃、12 000 r·min-1離心15 min；取60 μL上清液于2 mL進樣瓶。每個樣本各取10 μL混合成質控樣本。

1.4 代謝物檢測

參考文獻[17]、[18]方法檢測代謝物。流動相A為水(25 mM醋酸銨及25 mM氨水)，B為100%乙腈，洗脫梯度：0～0.5 min,95%B；0.5～7 min,95%B～65%B；7～8 min,65%B～40%B；8～9 min,40%B；9～9.1 min,40%B～95%B；9.1～12 min,95%B。進樣體積為1 μL。

1.5 質譜條件

AB 5600 Triple TOF質譜儀在控制軟件(Analyst TF 1.7, AB Sciex)控制下基于IDA功能進行一級、二級質譜數(shù)據采集。分別采用正、負離子模式采集。在每個數(shù)據采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質譜數(shù)據。轟擊能量：30 eV，15張二級譜圖每50 ms。ESI離子源參數(shù)設置：霧化氣壓(GS1)，60 Psi；輔助氣壓，60 Psi；氣簾氣壓，35 Psi；溫度，650℃；噴霧電壓，5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負離子模式)。

1.6 數(shù)據處理

參照文獻[19]方法進行數(shù)據處理。使用ProteoWizard軟件將質譜原始數(shù)據轉成mzXML格式，再使用XCMS(version 3.2)進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等處理。物質鑒定的數(shù)據處理及匹配：使用百邁客生物有限公司基于XCMS開發(fā)的程序及自建庫進行處理，minfrac設為0.5，cutoff設為0.8。采取t檢驗(Student’st-test)的P值與正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)模型的VIP(Variable importance in the projection)值相結合的方法來篩選差異代謝物，篩選的標準為VIP>1，且顯著性達到P<0.05。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下隴油7號OPLS-DA分析

利用OPLS-DA方法，將低溫處理后的處理組和常溫對照組隴油7號根部共12個樣品的標準數(shù)據進行分析(圖1)。從圖1可以看出，樣品處理組和對照組6個生物學重復的數(shù)據點檢測結果均很好地分成兩組，并分別集中在一起。OPLS-DA分析方法評價模型的預測參數(shù)有R2X，R2Y和Q2，其中R2X和R2Y分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這3個指標越接近于1時表示模型越穩(wěn)定可靠，Q2> 0.5時可認為是有效的模型[20]。本研究模型的評價參數(shù)R2X，R2Y和Q2分別為0.588、0.989和0.608，參數(shù)均超過0.5，說明本試驗建立的OPLS-DA模型可為后續(xù)的數(shù)據分析提供支持。

注：X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9為22℃ 處理6個生物學重復；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9為-4℃處理下6個生物學重復。Note: X1-4,X1-5,X1-6,X1-7,X1-8,X1-9： 6 biological replicates at 22℃；X5-4,X5-5,X5-6,X5-7,X5-8,X5-9：6 biological replicates at -4℃.圖1 隴油7號低溫處理與常溫對照正交偏最小二乘法-判別分析得分Fig.1 OPLS-DA score plots of two groups of samples

2.2 低溫脅迫下冬油菜隴油7號根部差異代謝物的篩選及KEGG富集分析

通過火山圖可以快速地查看代謝物在兩個組中表達水平的差異，以及差異的統(tǒng)計學顯著性。圖2為隴油7號根部差異表達火山圖。

圖2 隴油7號低溫處理與常溫對照差異代謝物篩選火山圖Fig.2 The volcano plot for two groups of samples

低溫處理組較對照組在正離子模式下上調代謝物116個，下調代謝物96個。在標準譜庫進行對比分析后，確定了124個代謝產物的結構；在負離子模式下上調代謝物122個，下調代謝物39個。在標準譜庫鑒定到101個代謝物。

KEGG富集分析結果顯示(圖3)，在正離子模式下，代謝物主要富集到果糖和甘露糖代謝、醚脂類代謝、花生四烯酸代謝、苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、α-亞麻酸代謝、氨基酸生物合成和亞油酸代謝等20個通路中；在負離子模式下，代謝物主要富集到淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、半乳糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等10個通路。這些代謝通路可能與隴油7號抗寒代謝途徑有關。

注：A—正離子模式，B—負離子模式。Note: A — positive ion mode；B — negative ion mode.圖3 隴油7號低溫處理與常溫對照差異代謝物KEGG富集Fig.3 Enrichment plot for two groups of samples

2.3 低溫脅迫處理后冬油菜隴油7號根部差異代謝物的鑒定結果

根據VIP>1且P<0.05篩選條件下的OPLS-DA結果，隴油7號根部共有225個已知代謝產物在低溫和常溫條件下有較大差異。對鑒定到的8種糖代謝相關產物、4種氨基酸類、甘油磷酰膽堿、黃酮、6種磷脂進一步分析(表1)，各類成分在低溫處理后上下調模式不同。低溫促進糖(除鼠李糖外)、黃酮、賴氨酸-纈氨酸、脯氨酸-色氨酸的積累。磷脂的變化存在差異，與對照相比，低溫下磷脂酰膽堿(PC)類(除o-16∶0/18∶0亞類外)上調，脂酰乙醇胺(PE)類和磷脂酰絲氨酸(PS)類下調，而磷脂酰肌醇(PI)類、磷脂酸(PA)類及磷脂酰甘油(PG)類的變化因亞類而異。

表1 低溫脅迫條件下隴油7號根部差異代謝物比較

3 討 論

3.1 隴油7號在低溫條件下調節(jié)糖和氨基酸代謝水平適應環(huán)境

植物在遭受非生物脅迫時可產生脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等滲透調節(jié)物質抵御外界壓力損傷[21]。低溫嚴重影響植物的生長和發(fā)育，在長期的抗寒鍛煉中，植物獲取了不同適應低溫脅迫的能力。有些植物在低溫逆境脅迫時通過改變蔗糖及其衍生物寡糖的含量適應不利環(huán)境，蔗糖的積累能顯著降低植物的冰點，增強細胞的保水力[22]。低溫條件下，葡萄藤會積累更多的海藻糖[23]，葡萄藤花序在冷處理下蔗糖含量更豐富[24]。擬南芥植株響應冷脅迫的代謝研究結果表明，葡萄糖、果糖和棉子糖等糖類對溫度脅迫具有重要作用[25]。植物組織中的氨基酸能對冷脅迫做出響應，特別是脯氨酸水平增加是抗冷機制之一[26]。隴油7號根系低溫處理后與對照相比，KEGG分析代謝物主要富集到果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝途徑及氨基酸生物合成通路。甘露糖、塔羅糖、阿洛糖、蔗糖、海藻糖和棉子糖6種糖類差異倍數(shù)均在1.2以上，賴氨酸-纈氨酸和脯氨酸-色氨酸含量提高。表明低溫脅迫下，含有氨基酸和糖類物質的代謝網絡對低溫脅迫具有重要作用，冬油菜可主動積累體內糖類和氨基酸類滲透調節(jié)物質，提高細胞液濃度，維持滲透壓，保護膜系統(tǒng)組分，提高抗寒性。

3.2 磷脂類代謝物質對隴油7號抗寒性具有重要作用

植物細胞膜是所有細胞結構和功能的組成部分，是細胞與外界環(huán)境聯(lián)系的直接界面，對環(huán)境變化非常敏感[27]。前人在細胞膜對溫度變化的響應方面做了大量的研究，結果表明，低溫誘導首先引起植物膜損傷[28-30]。磷脂是生物膜的主要組成成分。磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)及磷脂酰甘油(PG)是植物中主要的磷脂分子。Uemura等[31]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫處理后，磷脂的比例有增加的趨勢。PC是可提高膜穩(wěn)定性的雙層脂質，而PE更傾向于過渡到非雙層結構[32],PG分子水平與植物的冷敏感性呈正相關[33],PI在應激反應中發(fā)揮重要作用[34]。PA是一類最重要的磷脂信使物質，參與多種逆境與激素的信息傳遞過程[35]。本研究在隴油7號根部檢測出6類磷脂，在低溫處理后其中PC亞類上調， PE和PS下調，PG、PI和PA亞類部分上調，部分下調。研究表明，不同磷脂種類之間的轉換對細胞膜穩(wěn)定性有一定影響[36]。冷凍脅迫誘導各種膜磷脂的降解和轉化以及?；湶伙柡投鹊淖兓萚37]，植物更偏好脂質重組適應溫度變化[38]。低溫脅迫下，隴油7號可調節(jié)根部磷脂代謝，維持細胞膜的穩(wěn)定性，免受低溫脅迫的危害。

4 結 論

本試驗基于非靶向代謝組技術的研究方法，對強抗寒性冬油菜品種隴油7號根系在低溫脅迫處理后的代謝產物進行了分離與鑒定。糖類、氨基酸、甘油磷酰膽堿、黃酮、6種磷脂(PG、PC、PE、PI、PS和 PA)等均得到鑒定。低溫脅迫下，糖、賴氨酸-纈氨酸、脯氨酸-色氨酸積累，磷脂中PC增加，PE和PS下降， PI、PA和PG類的變化因亞類而異。隴油7號在低溫條件下調節(jié)糖、氨基酸和磷脂類代謝水平適應環(huán)境。研究結果為冬油菜抗寒相關物質代謝深入研究奠定基礎。