不同品種和花期梔子花揮發(fā)性物質(zhì)的主成分和聚類分析

盧路路 樊怡靈 鄧 珂 許光治 王 艷 張有做 倪勤學(xué)

(浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300)

梔子花(Gardeniajasminoides)為茜草科梔子屬的花朵，原產(chǎn)于我國(guó)中部，是我國(guó)著名的八大香花植物之一[1-2]。我國(guó)具有豐富的梔子屬資源，包括梔子、狹葉梔子、大黃梔子、海南梔子、匙葉梔子以及卷萼梔子6種梔子屬植物[3]，現(xiàn)廣泛分布于四川、江蘇、浙江等地[4]。梔子鮮花目前主要用于梔子花浸膏或制作精油，是名貴的花香香料之一，多用于高級(jí)香水、香皂和化妝品香精之中，GB 2760-2014[5]也允許將梔子花浸膏用于食品，新鮮的花朵還可以作為飲食的原料[6-8]，此外梔子花粉中還含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素C以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9]，被稱為“天然食品”“完全的營(yíng)養(yǎng)品”[10]。近年來(lái)，隨著對(duì)芳香療法以及植物揮發(fā)性有機(jī)物研究的深入與重視，植物揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)人體的積極作用逐漸得到大家重視，已經(jīng)引起了較大的關(guān)注。研究表明，薰衣草[11]、梔子花[12]、茉莉花[13]、檸檬草[14]等芳香植物揮發(fā)物具有抗衰老、鎮(zhèn)靜、抗憂郁和抗氧化等生理功能與藥用價(jià)值，研究鮮花活體香氣成分有助于進(jìn)一步了解鮮花發(fā)揮功能功效的原理。然而目前國(guó)內(nèi)研究主要集中于梔子果，針對(duì)梔子花的研究甚少，而有關(guān)不同品種梔子花揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)方面的研究更欠缺。譚誼談等[15]表明重慶北碚區(qū)的梔子花隨著花期的延續(xù)酯類物質(zhì)和烴類物質(zhì)含量上升，而萜烯類物質(zhì)的含量呈先下降后上升的趨勢(shì)。為便于梔子花資源的開(kāi)發(fā)利用，很有必要對(duì)不同品種和不同花期梔子花的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究。

固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)是一種不使用有機(jī)溶劑的新型采樣技術(shù)，根據(jù)“相似相溶”原理對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行萃取和預(yù)富集，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，具有待測(cè)物質(zhì)用量少、成本低、耗時(shí)短以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并且能更真實(shí)地反映出樣品中揮發(fā)性成分及組成，因而被廣泛應(yīng)用于香氣物質(zhì)的分析[16-18]。

本研究采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(head space solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)技術(shù)，結(jié)合主成分分析法對(duì)山梔子、水梔子、狹葉梔子和重瓣梔子4個(gè)梔子花品種的花蕾期Ⅰ、盛開(kāi)期Ⅱ和衰敗期Ⅲ 3個(gè)花期的12個(gè)梔子花樣品進(jìn)行分析，對(duì)梔子花的香氣成分進(jìn)行初步探索，并對(duì)其特征風(fēng)味成分進(jìn)行研究，以期為混合采摘不同品種不同花期的梔子花提供基礎(chǔ)判定，且為梔子花資源后續(xù)的綜合開(kāi)發(fā)與利用提供有力的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子花采自浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)及平山種植基地，如圖1所示根據(jù)花瓣盛開(kāi)的情況將其分為3類：花蕾期Ⅰ(花瓣并未完全露出，未見(jiàn)內(nèi)層花瓣，且外層花瓣向花心傾斜)、盛開(kāi)期Ⅱ(花瓣完全露出，外層花瓣上翹，且花瓣新鮮)、衰敗期Ⅲ(花瓣完全露出，外層花瓣向花心相反方向開(kāi)放，且花瓣萎焉)。將12個(gè)梔子花樣品進(jìn)行編號(hào)，如表1。

圖1 12個(gè)梔子花樣品

表1 梔子花樣品編號(hào)

1.2 主要儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010 Plus氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；57330-U手動(dòng)固相微萃取(solid phase micro extraction，SPME)進(jìn)樣器、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB)萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SPME條件 取1 g梔子花鮮花，轉(zhuǎn)移至15 mL頂空螺紋瓶中，使用65 μm PDMS/DVB萃取頭插入頂空螺紋瓶，于室溫條件下頂空萃取10 min。將萃取頭插入色譜儀進(jìn)樣口進(jìn)行解吸，解吸溫度250℃，解吸時(shí)間5 min。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography - mass spectrometry, GC-MS)條件 (1)GC條件：色譜柱：HP125 m×0.2 mm×0.33 μm彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：氦氣(純度>99.999 5%)；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣溫度：250℃；不分流進(jìn)樣模式。色譜柱設(shè)置起始溫度為40℃，保持3 min后以5℃·min-1升至80℃，保持3 min， 接著以5℃·min-1升溫至300℃，保持3 min。

(2)MS條件：采用全掃描模式，70 eV EI電離，全掃描方法的質(zhì)量范圍設(shè)為35～600 m·min-1。接口溫度250℃，傳輸線和離子源溫度均設(shè)為250℃。

1.3.3 成分定性及定量分析 經(jīng)GC-MS得到揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖，各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)庫(kù)進(jìn)行檢索匹配，同時(shí)結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間，參考文獻(xiàn)[19-24]確認(rèn)香氣物質(zhì)的化學(xué)成分；經(jīng)GC-MS檢出的各組分采用峰面積歸一化法[25]確定各化合物的相對(duì)含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 利用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、主成分分析(principal component analysis,PCA) 和聚類分析(clustering analysis,CA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種和花期梔子花揮發(fā)性物質(zhì)的比較

由表2可知，供試的12個(gè)梔子花樣品通過(guò)HS-SPME-GC-MS分析共檢出52種揮發(fā)性物質(zhì)，包含7種類型的揮發(fā)性物質(zhì)：烯烴(10種)、烷烴(2種)、醛類(1種)、醇類(8種)、酚類(1種)、酯類(29種)和1種吲哚揮發(fā)性物質(zhì)，其相對(duì)含量見(jiàn)表3。

表2 梔子花不同品種不同花期揮發(fā)性成分相對(duì)含量

表2(續(xù))

表3 不同梔子花樣品揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對(duì)含量

由表3可知，烯烴類、醇類和酯類是12個(gè)梔子花樣品揮發(fā)性物質(zhì)所占含量最多的3類，占總含量的90%以上。由表2可知，葉醇、芳樟醇、羅勒烯、金合歡烯以及戊酸葉醇酯在12個(gè)梔子花樣品中的相對(duì)含量均較高。梔子花樣品中部分揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量高、香氣閾值低且具有獨(dú)特的香型，對(duì)梔子花的香氣有明顯的貢獻(xiàn)，如羅勒烯具有溫暖的草香、甜香并伴有橙花油的香氣[26]，芳樟醇具有鈴蘭香味[27]，金合歡烯是倍半萜類香料成分，具有花香和木香氣息[28]，正己醇具有水果清芬的香氣，葉醇具有強(qiáng)烈的嫩葉清香氣味。

花蕾期Ⅰ中，水梔子中葉醇的相對(duì)含量明顯高于狹葉梔子中的相對(duì)含量，而在山梔子和重瓣梔子中并未檢測(cè)到葉醇；盛開(kāi)期Ⅱ中，山梔子和重瓣梔子中檢出了葉醇，水梔子和狹葉梔子中葉醇的相對(duì)含量與花蕾期Ⅰ相比都有所減少；衰敗期Ⅲ中，狹葉梔子葉醇相對(duì)含量陡然上升至15.42%，山梔子葉醇含量與盛開(kāi)期Ⅱ相比無(wú)較大變化，而水梔子和重瓣梔子中并未檢出葉醇。在12個(gè)梔子花樣品中均檢出羅勒烯、芳樟醇和金合歡烯等。各品種梔子花芳樟醇的相對(duì)含量變化趨勢(shì)一致，均為衰敗期Ⅲ>盛開(kāi)期Ⅱ>花蕾期Ⅰ，即隨著花期的延長(zhǎng)，梔子花芳樟醇的相對(duì)含量逐步上升。山梔子和水梔子羅勒烯以及重瓣梔子金合歡烯的相對(duì)含量均隨著花期延長(zhǎng)先下降后上升。山梔子和狹葉梔子金合歡烯以及重瓣梔子羅勒烯的相對(duì)含量均隨著花期的延續(xù)下降。狹葉梔子羅勒烯和水梔子金合歡烯的相對(duì)含量隨著花期的延續(xù)均上升。綜上，不同品種不同花期梔子花間揮發(fā)性成分種類與總量變化無(wú)明顯規(guī)律性。

2.2 梔子花揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析

將12個(gè)梔子花樣品中檢測(cè)到的52種揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量組建成12×52的矩陣，利用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行PCA分析，相關(guān)矩陣的特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率如表4所示。可以看出，總方差61.771%的貢獻(xiàn)率來(lái)自前3個(gè)主成分，其方差貢獻(xiàn)率分別為27.046%、20.666%、14.059%，說(shuō)明這3個(gè)主成分基本包含了梔子花樣品的絕大部分信息。因此，本試驗(yàn)選擇前3個(gè)主成分因子進(jìn)行分析。

表4 主成分的方差貢獻(xiàn)率

以PC1、PC2和PC3為三維坐標(biāo)軸，繪制其因子負(fù)荷散點(diǎn)圖，得到52種梔子花揮發(fā)性物質(zhì)的三維因子載荷散點(diǎn)圖(圖2)。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為27.046%，其中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有乙酸葉醇酯、苯甲酸甲酯、丙酸己酯、丁酸葉醇酯、乙酸芐酯、苯甲酸乙酯(具有膏香、蜜甜的香氣)、水楊酸甲酯、己酸葉醇酯、β-石竹烯、茉莉內(nèi)酯、γ-杜松烯、反式-橙花叔醇、苯甲酸葉醇酯和苯甲酸己酯，其中反式-橙花叔醇的載荷量最高，為0.918；載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)有(E)-β-羅勒烯、羅勒烯、別羅勒烯，其中(E)-β-羅勒烯和羅勒烯的載荷量分別為0.731和0.726。第2主成分方差貢獻(xiàn)率為20.666%，其中載荷量較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有乙酸己酯、丁酸異戊酯、丁酸己酯、戊酸葉醇酯、異戊酸己酯、吲哚、苯甲酸丁酯、苯甲酸異戊酯，其中丁酸己酯的載荷量最高，為0.893；載荷較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有2-甲基丁酸甲酯、芳樟醇、4,6-二甲基十二烷、金合歡烯，其中芳樟醇和金合歡烯載荷量較高，分別為0.633和0.696。第3主成分方差貢獻(xiàn)率為14.059%，其中載荷量較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要有反式異丁香酚、惕各酸苯乙酯，其中反式異丁香酚的載荷量最高，為0.723；載荷量較高的負(fù)影響揮發(fā)性物質(zhì)主要是2-甲基丁醇、惕各酸乙酯、十六醛，其中2-甲基丁醇載荷量最高，為0.726。

圖2 12個(gè)梔子花樣品的52種揮發(fā)性物質(zhì)的3D載荷得分圖

由圖3可知，12個(gè)梔子花樣品可區(qū)分為2類。其中花蕾期Ⅰ的山梔子、3個(gè)花期的水梔子、以及花蕾期Ⅰ的重瓣梔子歸為一個(gè)集群；其他7個(gè)樣品歸為一個(gè)集群。同一個(gè)集群的梔子花樣品香型相似，相似香型的梔子花可以考慮混合采集應(yīng)用到后續(xù)的生產(chǎn)與加工中。

圖3 12個(gè)梔子花樣品的主成分3D得分圖

2.3 梔子花揮發(fā)性物質(zhì)聚類分析

本試驗(yàn)采用Q型聚類方式，度量標(biāo)準(zhǔn)為歐氏距離的平方，通過(guò)組間連接的方式，以52個(gè)梔子花的揮發(fā)性物質(zhì)作為變量，對(duì)4個(gè)不同品種3個(gè)花期梔子花的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行聚類分析(圖4)。結(jié)果表明，當(dāng)橫坐標(biāo)距離為15時(shí)，可以將12個(gè)梔子花樣品分為2個(gè)集群，花蕾期Ⅰ的山梔子、3個(gè)花期的水梔子、花蕾期Ⅰ的重瓣梔子歸為1個(gè)集群,剩下的7個(gè)樣品歸為1個(gè)集群；距離為10時(shí)，12個(gè)樣品分為5個(gè)集群，花蕾期Ⅰ山梔子和重瓣梔子以及衰敗期Ⅲ水梔子為1個(gè)集群，花蕾期Ⅰ和盛開(kāi)期Ⅱ的水梔子為1個(gè)集群，花蕾期Ⅰ和盛開(kāi)期Ⅱ的狹葉梔子為1個(gè)集群，盛開(kāi)期Ⅱ的山梔子和重瓣梔子、衰敗期Ⅲ的山梔子和狹葉梔子為1個(gè)集群，衰敗期Ⅲ重瓣梔子單獨(dú)為1個(gè)集群。距離為5時(shí)，12個(gè)樣品被分為6個(gè)集群，其他分組不變，盛花期Ⅱ重瓣梔子被單獨(dú)劃為一個(gè)集群。PCA的結(jié)果與CA刻度為15時(shí)的結(jié)果相一致，說(shuō)明通過(guò)兩者的分析，均可以對(duì)12個(gè)梔子花樣品進(jìn)行分類。CA根據(jù)刻度不同可以有多種分類結(jié)果，且CA模型結(jié)論直觀簡(jiǎn)明；而PCA根據(jù)得分僅獲得一種側(cè)重于信息貢獻(xiàn)影響力綜合評(píng)價(jià)的分類結(jié)果。通過(guò)PCA和CA對(duì)不同品種和不同花期梔子花的香型進(jìn)行判定分類，可以為后期梔子花的采集提供理論依據(jù)，即選擇同一集群中的梔子花，生產(chǎn)加工得到的產(chǎn)品香型相似，從而為后續(xù)的生產(chǎn)進(jìn)行指導(dǎo)。

圖4 12個(gè)梔子花樣品的CA樹(shù)狀圖

3 討論

任何一種花都存在幾十種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分的種類和含量對(duì)花的香氣品質(zhì)起著重要作用。陳彤等[29]在梔子花中共鑒定出70種化合物，主要為醇類、酯類、烴類和酮類化合物。黃昕蕾等[30]研究發(fā)現(xiàn)鼓槌石斛不同花期揮發(fā)性物質(zhì)的種類呈先上升后下降的趨勢(shì)，在盛花期達(dá)到最高。薛丹等[31]研究發(fā)現(xiàn)大花梔子中羅勒烯、芳樟醇和金合歡烯的相對(duì)含量較高。本研究結(jié)果表明，隨著花期的延續(xù)，揮發(fā)性物質(zhì)的種類和總量呈先升高后降低的趨勢(shì)。從種類上講，花蕾期最少，盛花期最多，符合鮮花盛開(kāi)過(guò)程中香味逐漸濃郁的現(xiàn)象，這與前人的結(jié)果基本一致；從總量上講，雖然衰敗期揮發(fā)性物質(zhì)的種類與盛花期相接近，但各類香氣成分相對(duì)含量普遍低于盛花期，與譚誼談等[15]的研究一致，也與鮮花普遍在盛開(kāi)期香氣最濃郁的觀念相符。造成各類揮發(fā)性成分含量存在較大差異可能與采摘時(shí)間、采摘地點(diǎn)以及在運(yùn)輸過(guò)程中揮發(fā)性化合物自身的氧化還原反應(yīng)等有關(guān)。本試驗(yàn)只選用了臨安地區(qū)的梔子花樣品進(jìn)行分析，后續(xù)可研究不同產(chǎn)地對(duì)梔子花揮發(fā)性物質(zhì)的影響。

4 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-GC-MS法對(duì)4個(gè)品種3個(gè)花期梔子花的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，供試的12個(gè)梔子花樣品共鑒定出52種揮發(fā)性物質(zhì)，其中主要包括烯烴類、烷烴類、醛類、醇類、酚類和酯類六大類。對(duì)12個(gè)梔子花樣品的52種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析，對(duì)前3個(gè)主成分得分進(jìn)行分析，結(jié)果表明12個(gè)梔子花樣品可分為2個(gè)集群，花蕾期Ⅰ山梔子、花蕾期Ⅰ重瓣梔子以及3個(gè)花期的水梔子歸為1個(gè)集群，另外7個(gè)樣品歸于1個(gè)集群。聚類分析在刻度15時(shí)的結(jié)果與主成分分析一致，即2種方法均能較好地反映梔子花樣品間的差異性。本研究為梔子花在揮發(fā)性物質(zhì)的分類選擇、原料的混合采摘以及后期產(chǎn)品的生產(chǎn)加工提供了依據(jù)。