基于礦質元素指紋的粉葛產(chǎn)地溯源研究

賀媛媛 孫倩倩 郭波莉 張 磊

(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193)

中藥材粉葛(PuerariaethomsoniiRadix)是豆科植物甘葛藤(PuerariaethomsoniiBenth) 的干燥根。傳統(tǒng)中藥學上，粉葛主治解肌退熱，具有生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡以及解酒毒等功效[1]。粉葛富含淀粉、微量元素以及葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分，具有降三高、抗心律失常、擴張冠狀血管、腦保護、抗氧化、抗腫瘤以及提高記憶等功效[2]。我國是粉葛生產(chǎn)大國，每年日本、東南亞、歐美等國家從我國進口大量粉葛初級產(chǎn)品，經(jīng)深加工后生產(chǎn)相關的藥品和保健品。2012年，世界糧農(nóng)組織等權威機構已經(jīng)將葛根列入世界六大糧食作物之一[3]。市場對粉葛的需求量逐年增加，各地種植面積不斷攀升。

葛根素、大豆苷等異黃酮成分含量直接影響粉葛質量。不同產(chǎn)地葛根中的總黃酮、葛根素、大豆苷元等含量均存在顯著差異。其中，不同產(chǎn)地葛根中葛根黃酮含量相差約3倍，葛根素含量相差約20倍，大豆苷元含量相差約30倍[4]。目前，粉葛市場魚龍混雜，不同產(chǎn)地來源的粉葛產(chǎn)品品質良莠不齊。在經(jīng)濟利益的驅動下，不法生產(chǎn)商以次充好，且虛假標簽現(xiàn)象極為嚴重，粉葛產(chǎn)地的真實性急需確證[5]。但由于不同地理來源粉葛特征相似，僅采用傳統(tǒng)的鑒別方法很難準確鑒別其產(chǎn)地。

前人對葛根產(chǎn)地溯源研究主要采用紅外光譜[6-8]、熒光[9]和近紅外光譜[10]等方法，通過測定其活性成分以判別葛根產(chǎn)地來源。但活性成分受品種、貯藏時間等因素影響較大，建立的產(chǎn)地判別模型的穩(wěn)定性有待進一步提高。生物體礦質元素因其自身不能合成，必需從土壤、水等周圍環(huán)境中獲取，因而帶有其產(chǎn)地特有的地理指紋信息，相比生物體有機成分而言，礦質元素指紋對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別更為穩(wěn)定。目前，礦質元素指紋分析已應用于糧谷類[11]、果蔬類[12]、茶葉[13]及多種中藥材[14-15]等植物源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源[16]。逐步判別分析是在判別分析的基礎上，根據(jù)Wilk’s Lambda準則分析將數(shù)據(jù)逐步輸入，同時采用留一法進行交叉驗證，以此獲得區(qū)分不同地域來源樣品的最佳判別變量，屬于有監(jiān)督的模式識別方法。Zhang等[14]采用礦質元素指紋對中寧及中寧周邊枸杞進行分析，結合逐步判別分析表明，經(jīng)回代檢驗和交叉驗證中寧枸杞的正確判別率分別為95.7%和85.7%。

本研究重點分析礦質元素指紋在粉葛產(chǎn)地溯源中的可行性，并結合化學計量學分析篩選有效的產(chǎn)地溯源指標，旨在為粉葛原產(chǎn)地鑒別提供方法，為維護粉葛行業(yè)誠信體系，保障公平競爭，促進粉葛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本研究采集了43份人工種植粉葛樣品，其中陜西樣品14份、湖北樣品15份、廣西樣品14份，樣品均于2018年12月至2019年1月采收。樣品采集具體地理信息以及種植期間氣象信息見表1。

表1 樣品采樣地地理位置和種植期間氣象信息

選擇各地粉葛樣品種植區(qū)域，根據(jù)區(qū)域面積大小，按照土壤樣品采集技術規(guī)范采集表層(0～20 cm)土壤樣品；剔除土壤中石子、植物根須等雜物，將土壤樣品混勻，采用四分法去除多余土壤樣品。依照此原則，共采集土壤樣品19份，其中陜西4份、湖北10份、廣西5份。

試驗所用試劑包括：硝酸(北京化學試劑研究所，BV-Ⅲ)、雙氧水(北京化學試劑研究所，BV-Ⅲ)、氫氟酸(阿拉丁公司，分析純)、高氯酸(北京化學試劑研究所，優(yōu)級純)、18.2 MΩ·cm-1超純水(美國Millipore 公司)、Part#5183-4688環(huán)境標準液(美國Agilent公司)、人參標準物質(GBW 10027，國家標準物質研究中心)、土壤標準物質(GBW 07446，國家標準物質研究中心)。

1.2 主要儀器與設備

LGJ-10冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠；DE-250中藥粉碎機，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；MARS 240/50微波消解儀，美國CEM公司；7700電感耦合等離子體質譜儀，美國Agilent公司；QM -3SP2行星式球磨機，南京大學儀器廠。

1.3 樣品測定

1.3.1 樣品預處理 粉葛樣品：采收后的粉葛先用自來水充分清洗去除表皮泥土，后用去離子水沖洗3遍，去皮、切丁，置于冷凍干燥機對其進行冷凍干燥72 h (-60～-55℃)；凍干樣品用中藥粉碎機進行粉碎，過200目篩后于聚乙烯塑料瓶中密封保存，待測。

土壤樣品：在自然條件下陰干后，采用球磨儀將土壤磨碎，過200目篩網(wǎng)，獲得細粉，裝入聚乙烯塑料袋中保存，待測。

1.3.2 樣品消解 粉葛樣品：稱取粉葛樣品0.25 g于Teflon消解管中，加入6 mL硝酸，使其與樣品充分反應2 h后，再加入2 mL雙氧水，繼續(xù)反應0.5 h后，將其有序地放入微波消解儀中消解，以去除樣品中的有機物。微波消解程序：在1 600 W功率下經(jīng)8 min升溫至120℃，保持2 min；保持功率不變，繼續(xù)升溫5 min至160℃，保持5 min；保持功率不變，升溫5 min至180℃，保持30 min。將消解管從微波消解儀中按序取出，放在180℃趕酸板上進行趕酸約40 min后將其定容至100 mL[14]，4℃儲存，備測。

土壤樣品：稱取土壤樣品0.05 g于Teflon消解罐中，加入8 mL濃硝酸，讓其與樣品充分反應2 h后，加入2 mL氫氟酸，將其有序放入微波消解儀進行消解，以去除土壤樣品中的有機物。微波消解程序：升溫10 min使得消解溫度升至120℃，在此溫度下保持4 min；繼續(xù)升溫8 min，使得消解溫度達到160℃，在此溫度下保持4 min；持續(xù)升溫5 min，待消解溫度達到185℃，在此溫度下保持25 min，整個過程功率始終保持為1 600 W。微波消解結束后，再加入1 mL高氯酸，然后有序放在185℃趕酸板上趕酸50 min，定容至100 mL塑料方瓶[14]，于4℃儲存?zhèn)錅y。

1.3.3 樣品元素含量測定 取10 mL上述溶液注入到待測試塑料試管中，在電感耦合等離子體質譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)上進行B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti元素含量的測定。ICP-MS儀器參數(shù)如下：射頻功率(radio frequency, RF)為1 280 W，冷卻氣流速為1.47 L·min-1，霧化室溫度為2℃，蠕動泵為0.10 rps，氬氣作為載氣，其流速和輔助氣流速均為1 L·min-1。Ge、In和Bi為在線內標以實時監(jiān)測儀器穩(wěn)定性。試驗所有樣品經(jīng)3次重復測定，當內標元素的相對標準差>5% 時，樣品需重新測定。本研究粉葛樣品分析選擇GBW 10027人參粉成分分析標準物質作為參考材料，土壤樣品選擇GBW 07446土壤成分分析標準物質作為參考材料對試驗操作全過程進行控制。標準品回收率均在 85%～110% 之間。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行Shaprio-Wilk正態(tài)分析、描述性分析、方差分析(ANOVA)、Duncan’s多重比較。采用比率分析對各元素中的中位/平均居中變異系數(shù)(coefficient of variation，COV)進行計算，將設置的新變量K=1作為分母，其余連續(xù)變量作為分子進行計算[17]。采用多元統(tǒng)計分析中主成分分析(principal component analysis，PCA)、逐步判別分析(stepwise discriminant analysis，SLDA)和分層聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)對不同地域來源樣品進行分類，其中采用SIMCA 14.0軟件分析HCA，采用SPSS 22.0軟件分析PCA和SLDA。

2 結果與分析

2.1 粉葛中礦質元素含量特征

對粉葛中B、Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Co、Cu、Zn、Rb、Sr、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti 22種礦質元素進行Shapiro-Wilk正態(tài)分析(表2)。結果表明，各地域粉葛中Mg、P、K、Ca、Cu、Zn、Sr元素含量服從正態(tài)分布，其余元素含量在各地域間不完全符合或部分符合正態(tài)分布。對呈正態(tài)分布的元素取平均值，非正態(tài)分布的元素取其中位數(shù)和四分位數(shù)。粉葛中常量元素含量由大到小依次為K>Ca>P>Mg>Na，其必需微量元素含量呈現(xiàn)Zn>Cu>Mn>Mo>Co>B趨勢；輕稀土元素含量呈現(xiàn)Ce>La>Nd>Pr>Sm趨勢，稀土元素可作為產(chǎn)地鑒別的有效指標，因為這些元素很容易從土壤轉移到植物中[18]。Na、Mn、Co、Mo、Cd、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Ti元素的變異系數(shù)均超過了100%，說明不同產(chǎn)地來源粉葛中礦質元素含量有較大的差異。

表2 粉葛中礦質元素含量

表2(續(xù))

2.2 不同地域粉葛中礦質元素含量差異比較

由表3可知，除B、Cu外，其余礦質元素含量在不同產(chǎn)地間均存在不同程度的顯著性差異。Duncan’s多重比較分析結果表明，不同地域粉葛礦質元素含量有其特有的指紋信息。陜西粉葛中Co、Sr、Cd、Ba、La、Ce、Pr、Nd和Sm元素含量最高；湖北粉葛中Ca和Mo含量最高；廣西粉葛中Na、P、K、Zn、Rb和Ti元素含量最高。

表3 不同產(chǎn)地粉葛礦質元素含量差異分析

2.3 礦質元素指紋對粉葛產(chǎn)地鑒別分析

2.3.1 PCA分析 主成分分析屬于無監(jiān)督的模式，通過對變量進行降維，篩選出數(shù)據(jù)集中的主要變異指標。結果表明，前5個主成分累積方差貢獻率為80.08%。為便于直觀分析，選取前三個主成分得分繪制散點圖，其中第一主成分(PC1)可以解釋總方差變異的29.71%，第二主成分(PC2)涵蓋了16.34%的樣品信息，第三主成分(PC3)涵蓋了13.39%的樣品信息(圖1)。從載荷占比情況可知，第一主成分中Mn、Co、Sr、Cd、Cs、La、Ce、Pr、Nd、Sm和Ti載荷較大，與顯著性分析中陜西粉葛樣品信息相符；在第二主成分中Mg、Ca和Rb載荷較大，主要包含了湖北粉葛元素含量信息；第三主成分中P、K載荷較大，主要包含了廣西粉葛元素含量信息(表4)。因此，這3個地域粉葛礦質元素分布呈現(xiàn)一定的規(guī)律特征。

表4 粉葛礦質元素指紋前5個主成分中各變量的特征向量及累積方差貢獻率

圖1 不同地域粉葛礦質元素含量前3個主成分得分散點圖

2.3.2 SLDA分析 為進一步了解礦質元素指紋對粉葛產(chǎn)地的判別效果，對粉葛中存在顯著性差異的20種礦質元素進行逐步判別分析，該判別函數(shù)采用回代檢驗和交叉驗證兩種方法進行驗證。結果表明，Mg、P、Co、Rb、Sr 5種元素被引入判別模型中，回代檢驗和交叉驗證整體判別率分別為97.7%和93.0%(表5)。利用兩個判別函數(shù)得分作圖，不同地域樣品具有其特有的空間分布，僅有3個樣品被錯判(圖2)。

表5 不同地域粉葛逐步判別分析分類結果

圖2 不同地域粉葛樣品判別函數(shù)得分圖

2.3.3 HCA分析 為進一步可視化各樣品經(jīng)判別后所屬分類，對其進行了分層聚類分析。分層聚類分析使用平方歐式距離來識別和聚類樣本，屬于有監(jiān)督學習。由圖3可知，僅有廣西的1號樣品被錯判給湖北，13號樣品被錯判給陜西；湖北的7號樣品被錯判給廣西；陜西的13樣品被錯判給廣西?？梢?，礦質元素指紋結合聚類分析可有效實現(xiàn)對粉葛產(chǎn)地的區(qū)分。

圖3 不同地域粉葛礦質元素含量的分層聚類分析

2.4 土壤對粉葛礦質元素指紋的影響

由表6可知，陜西和廣西土壤中B、Na、Mg、P、Mn、Co、Zn、Sr、Mo、Ba存在顯著性差異，陜西和湖北土壤中Cu、Zn、Sr、Co含量存在顯著性差異，湖北和廣西土壤中Na、P、Mo含量存在顯著性差異(P<0.05)。為進一步探索土壤中礦質元素含量對粉葛中元素含量的影響，對粉葛和土壤中元素含量進行Pearson相關分析。結果表明，粉葛與其相應土壤中Rb、Sr、Ti元素含量呈極顯著正相關(P<0.01)，即粉葛樣品中Rb、Sr和Ti含量隨土壤元素含量的升高而增加。

表6 不同地域土壤礦質元素含量差異性分析

表6(續(xù))

3 討論

不同地域粉葛中礦質元素含量存在差異主要是受其采樣點所處地質帶的影響[14]。而地質帶的不同導致土壤的多樣化，因此不同地域土壤性質和土壤類型是造成粉葛元素含量差異的主要因素[11,14]。陜西省采樣點以棕壤和黃棕壤為主，湖北則以黃褐土和黃棕壤為主，廣西采樣點土壤類型屬于酸紫粘土。王潔[19]和盧勝[20]研究表明，不同土壤類型的濕度、pH值、質地、腐殖質等屬性不同，造成不同地域同一元素含量存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，不同地域粉葛中Mg、P、Co、Rb和Sr含量與其所在地域土壤中含量差異呈一致性。陜西粉葛中Co和Sr含量最高，廣西粉葛中P和Rb含量高于其余兩地。陜西和湖北粉葛中Mg含量無顯著差異，但均顯著高于廣西粉葛，其原因在于陜西和湖北采樣點地理位置相近。陜西粉葛中Co含量最高，可能與當?shù)赝寥乐蠧o含量較高有關，Kabata-Pendias等[21]研究表明，土壤中Co的富集會導致植物中該元素含量增加。大量研究表明，Rb和Sr可作為多數(shù)植源性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的有效指標。Zhao等[13]研究表明，茶葉中Rb、Sr含量與土壤中相應元素含量顯著相關，本研究也表明土壤中Rb和植物中Rb含量存在相關性。Nyholma等[22]研究表明酸性土壤會抑制鉀離子的吸收，促進植物中Rb的吸收。Rb作為表征土壤年代信息的主要元素[23]，常被應用于農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)地溯源。張龍等[23]研究表明Pb、Sr、Ba、Ga和V可作為杭白菊產(chǎn)地鑒別的特征指標，典則判別分析中，采用交叉驗證方法進行驗證，判別效果能達到97.1%。眾多實例表明，Sr元素可作為多數(shù)食品產(chǎn)地溯源的特征指標，如Tsialtas等[24]發(fā)現(xiàn)Sr含量受土壤特性的影響，在具有較高交換性鈣和陽離子交換能力的有機土壤中Sr含量顯著低于無機土壤。本研究篩選出的Rb和Sr元素與粉葛所在地域土壤密切相關，可作為粉葛產(chǎn)地溯源穩(wěn)定有效的指標。

此外，根據(jù)Ariyama等[25]和Qian等[26]研究表明，不同地域施肥類型、農(nóng)藥等栽培措施也可能對粉葛中礦質元素含量差異產(chǎn)生影響。廣西粉葛種植地主要以施加挪威復合肥為主，而陜西、湖北兩地以普通復合肥和農(nóng)家肥為主。不同地域粉葛中Mg、P元素的吸收還可能與施加肥料種類和含量有關，Hejcman等[27]研究表明，肥料中的P元素含量與農(nóng)產(chǎn)品中的P元素含量呈正相關。Qian等[26]研究表明，水稻中Co、Al和Ni元素含量受農(nóng)藥影響最大，故推測不同地域粉葛中Co含量差異還可能受農(nóng)藥的影響。

另一方面，不同地域溫濕度、光照、降水量等氣候條件的不同，也會導致植物中礦質元素含量不同。廣西氣候濕潤多雨，年降水量明顯高于陜西和湖北采樣點，致使不同地域土壤含水量存在差異，進而影響植物對礦質元素的吸收。

根據(jù)前人研究表明，基因型、年際、產(chǎn)地以及三因素之間的交互作用可能對不同地域粉葛礦質元素含量也有一定的影響。Zhao等[28]和Liu等[29]采用模型試驗通過多因素方差分析表明，基因型、年際、產(chǎn)地及其交互作用對小麥礦質元素含量有影響。本研究篩選的鑒別粉葛產(chǎn)地的礦質元素指標與賀媛媛等[30]研究野葛產(chǎn)地鑒別的B、Mg、P、Se和Sr 5種元素指標相比，Mg、P和Sr均被作為鑒別葛根產(chǎn)地的有效指標，但其余兩種元素存在一定差異，可能是因為生產(chǎn)方式的不同，本研究的葛根主要為人工栽培，而野葛生長在野生環(huán)境下，受外界環(huán)境影響較大。

4 結論

本研究選用有監(jiān)督的判別分析和無監(jiān)督的聚類分析與礦質元素指紋相結合，在一定程度上實現(xiàn)了不同產(chǎn)地粉葛樣品的分類。利用逐步判別分析篩選出Mg、P、Co、Rb和Sr 5種特征元素作為鑒別陜西、湖北和廣西粉葛樣品的有效指標。其中，陜西粉葛中Co和Sr含量最高，廣西粉葛中P和Rb含量高于其余兩地，陜西和湖北粉葛中Mg含量無顯著差異，但顯著高于廣西粉葛。經(jīng)交叉驗證整體正確判別率為93.0%，表明礦質元素指紋分析對粉葛產(chǎn)地溯源具有可行性。后續(xù)研究可對不同年際、不同基因型粉葛樣品進行分析，并進一步擴大樣本數(shù)量，建立穩(wěn)定有效的產(chǎn)地判別模型。