桃PpMADS1的克隆及對類胡蘿卜素合成基因的調(diào)控研究

余 凡 秦 娟 柴吉釧 方筱琴 曹士鋒 陳 偉 施麗愉 楊震峰,*

(1 浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

類胡蘿卜素是黃色、橙色和紅色果實中重要的呈色物質(zhì)，是一類天然色素的總稱。類胡蘿卜素作為有效清除單線態(tài)氧和自由基的抗氧化劑[1]，不僅可以提高健康成年人大腦認(rèn)知能力[2]，還能夠降低白內(nèi)障等眼部疾病[3]及癌癥[4]的發(fā)病率。近年來，隨著人們對營養(yǎng)健康關(guān)注度的提高，人們對類胡蘿卜素等功能性物質(zhì)需求也越來越大，因此，深入揭示果實中類胡蘿卜素的形成與調(diào)控研究正日益受到人們的廣泛關(guān)注。

高等植物類胡蘿卜素的生物合成在質(zhì)體中進(jìn)行，遵循類異戊二烯途徑，涉及的酶包括八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)、ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)、番茄紅素ε環(huán)化酶(lycopene ε-cyclase，LCYE)、番茄紅素β環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，LCYB)、β-羥基酶(β-hydroxylase，CHYB)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)。目前編碼這些酶的結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)在柑橘[5]、越桔[6]、榴蓮[7]、番木瓜[8]以及芒果[9]等許多果實中得到克隆和鑒定，且發(fā)現(xiàn)不同物種果實中參與類胡蘿卜素合成代謝的關(guān)鍵基因存在差異。

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是植物中研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[10]。MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在植物所有器官的形成發(fā)生及植物生長發(fā)育的全過程都扮演了重要角色[11]。近年來，有關(guān)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與果實成熟及品質(zhì)形成調(diào)控的研究已經(jīng)在番茄(Solanumlycopersicum)及多年生果樹上陸續(xù)報道。但有關(guān)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控果實類胡蘿卜素合成與積累的研究還主要集中在模式植物番茄中。研究發(fā)現(xiàn)，番茄果實成熟過程中類胡蘿卜素的積累由多個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控，且不同MADS-box成員在果實成熟期間的表達(dá)模式存在差異，對類胡蘿卜素合成的調(diào)控機(jī)制也不同。TAGL1、SlMADS-RIN、SlMBP15和SlCMB1都是番茄中正調(diào)控果實類胡蘿卜素合成的轉(zhuǎn)錄因子，它們的沉默表達(dá)均減少了果實中類胡蘿卜素的積累，降低了PSY1和PDS表達(dá)水平[12-15]。但這4個MADS-box基因中只有TAGL1和SlMADS-RIN的表達(dá)量與果實成熟期間類胡蘿卜素的積累相一致；SlMBP15表達(dá)量在果實成熟期間呈先上升后下降趨勢，并在果實轉(zhuǎn)色期達(dá)最高值；而SlCMB1表達(dá)量在整個成熟過程中逐漸下降。SlMADS1、SlFYFL和SlMBP8是負(fù)調(diào)控番茄果實類胡蘿卜素積累的轉(zhuǎn)錄抑制因子，但它們在果實成熟期間表達(dá)模式不同，SlMADS1和SlFYFL表達(dá)量逐漸下降，而SlMBP8表達(dá)量反而逐漸上升[16-18]。SlMADS1通過抑制PSY1基因表達(dá)降低類胡蘿卜素的含量，SlMBP8對PSY1、PDS和ZDS基因均有轉(zhuǎn)錄抑制作用。

類胡蘿卜素物質(zhì)的合成與積累是黃肉桃果實呈色的重要原因[19]。目前，有關(guān)桃果實類胡蘿卜素生物合成的分子機(jī)制已有一些研究。Cao等[20]報道黃肉桃果實采后貯藏期間類胡蘿卜素積累與PpPSY和PpCHYB的高表達(dá)密切相關(guān)。PpCHYB基因的差異表達(dá)也是導(dǎo)致套袋和不套袋桃果肉中類胡蘿卜素含量差異的重要原因[21]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面進(jìn)行的桃果實類胡蘿卜素合成的有關(guān)研究鮮見報道。為此，本研究以黃肉桃金麗和白肉桃湖景為試驗材料，克隆得到1個MADS-box基因PpMADS1，并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測PpMADS1基因在桃不同組織以及不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，并利用雙熒光素酶試驗分析PpMADS1對類胡蘿卜素合成基因PpPSY和PpCHYB啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，旨在為揭示MADS-box轉(zhuǎn)錄因子對桃果實類胡蘿卜素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為浙江省寧波市德馨園生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司種植的金麗及湖景水蜜桃品種。采集試樣芽、幼葉、花、軟核果實、硬核果實等不同組織樣，S1(盛花后35～45 d)、S2(盛花后55～65 d)、S3(盛花后95～105 d)、S4(盛花后105～120 d)和S5(盛花后120～150 d)期不同成熟度果實。采集完的樣品于1 h內(nèi)運送回實驗室，將各組織及成熟度的樣品于液氮中研磨成粉末狀，儲存于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用改進(jìn)的植物RNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek公司，美國)，根據(jù)使用說明提取不同組織和不同成熟度果實的總RNA。采用無RNase活性的DNaseI(Omega Bio-Tek公司，美國)去除總RNA中微量DNA污染，以備后續(xù)cDNA合成。采用NanoDro-p2000核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher Scientific，美國)測定RNA樣品的濃度和純度。通過Gel DOC XR+凝膠成像儀(美國BIO-RAD)觀察提取的RNA條帶的完整性、大小和清晰度。按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2 桃果實PpMADS1基因的克隆 利用桃基因庫(http://www.plantgdb.org/PeGDB/)以及桃果實發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選獲得1個MAD-box基因家族候選基因ppa010595m，對其進(jìn)行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，發(fā)現(xiàn)ppa010595m與預(yù)測的桃AGx3(GeneBank登錄號為XM_020561783.1)序列一致，因此將ppa010595m命名為PpMADS1基因。利用Primer 5.0軟件根據(jù)基因序列設(shè)計PCR擴(kuò)增特異性引物(表1)，委托上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。以合成的cDNA為模板，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增PpMADS1基因的開放閱讀框(oper reading frame, ORF)。反應(yīng)體系：5.8 μL ddH2O，0.2 μL dNTP Mix，2 μL SF Buffer，1 μL cDNA模板(濃度約為250 ng·μL-1)，上下游引物各0.4 μL，Phanta Super-Fidelity DNA pdynerase 0.2 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性8 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收純化連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，過夜培養(yǎng)，經(jīng)過菌落PCR挑取篩菌板上陽性克隆子，通過搖瓶培養(yǎng)提質(zhì)粒送華大基因測序。

1.2.3PpMADS1的生物信息學(xué)分析 利用ExPASy Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列、蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成、理論等電點、脂溶指數(shù)、親水指數(shù)等一級理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用SOPMA在線網(wǎng)站對PpMADS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用在線工具Protcomp9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。利用swissmodel在線軟件(http://swissmodel.expasy.org)對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具對PpMADS1進(jìn)行同源性比對分析，利用NCBI、ClustalX2.0、GeneDoc軟件對PpMADS1與同源基因進(jìn)行氨基酸序列比對分析。利用進(jìn)化樹分析軟件MEG4.1(http://www.megasoft-ware.net)中的鄰接(neighbor-joining，NJ)法[執(zhí)行參數(shù)：Poission correction correction、pairwise deletion和boot-strap(1 000次重復(fù))]對PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析 采用CFX96 Touch Real-Time PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，利用熒光定量引物進(jìn)行3步法qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR 程序設(shè)置為95℃初始變性7 min，95℃保持15 s，45℃退火30 s，75℃保持15 s，進(jìn)行39個循環(huán)。以PpTEF2基因(引物見表1，退火溫度為59℃)作為內(nèi)參基因，設(shè)置陰性對照。采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行qRT-PCR的數(shù)據(jù)分析，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 雙熒光素酶試驗 利用高保真酶Phanta? Super-Fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物科技有限公司)和ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)將PpPSY和PpCHYB啟動子序列插入pGreenII 0800-LUC載體的熒火蟲熒光素酶(firetty luciferase, LUC)上游作為報告基因，將PpMADS1的ORF序列重組到pGreenII 62-SK載體上作為效應(yīng)基因。陰性對照為空載體pGreenII 62-SK。構(gòu)建載體所需引物見表1。

表1 引物序列

農(nóng)桿菌侵染煙草及轉(zhuǎn)錄激活活性測定試驗參考Ba等[22]的方法，效應(yīng)基因和報告基因培養(yǎng)液的混合比例為8∶1，用醫(yī)用針筒吸取混合液侵染葉片背面，置于恒溫培養(yǎng)箱3 d，利用雙熒光素酶報告分析試劑盒(Promega，美國)和Luminoskan Ascent化學(xué)發(fā)光分析儀(Thermo，美國)測定葉片侵染區(qū)中螢火蟲光素酶(firefly luciferase，LUC)與海腎熒光素酶(renilla luciferase，REN)催化產(chǎn)生的熒光信號的比值。PpMADS1對PpPSY和PpCHYB啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性通過LUC/REN比值來計算，歸一化為陰性對照，每個處理重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpMADS1基因的克隆及序列分析

以桃果實cDNA為模板克隆得到長度為732 bp的PpMADS1的ORF序列見圖1。PpMADS1基因編碼的氨基酸一級結(jié)構(gòu)預(yù)測值見表2，PpMADS1蛋白酸堿性氨基酸組成比例和理論等電點顯示其呈堿性。不穩(wěn)定指數(shù)和脂溶指數(shù)表明PpMADS1不穩(wěn)定，具有較好脂溶性。親水指數(shù)表明PpMADS1表現(xiàn)出親水性。

Note: M: Marker.

表2 PpMADS1蛋白基本理化性質(zhì)

2.2 PpMADS1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，PpMADS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果中α-螺旋占55.97%，β-轉(zhuǎn)角占4.12%，延伸鏈約占8.64%，無規(guī)則卷曲占31.28%，說明PpMADS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主要構(gòu)成元件，這與PpMADS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致(圖3)。對PpMADS1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，PpMADS1定位在細(xì)胞核中的可能性最大，符合轉(zhuǎn)錄因子的功能定位特征。

圖2 PpMADS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3 PpMADS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 PpMADS1氨基酸序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載桃PpMADS1基因的同源序列，物種包括烏梅(Prunusmume)，中國櫻桃(Prunuspseudocerasus)，野黑櫻桃(Prunusserotina)，粳稻(Kerriajaponica)，蘋果(Malusdomestica)，沙梨(Pyruspyrifolia)，白梨(Pyrusxbretschneideri)，番茄等。同源性分析發(fā)現(xiàn)PpMADS1與烏梅(XP_008225496.1)的氨基酸相似率最高，達(dá)到100%，與中國櫻桃(AIU94283.1)氨基酸序列相似率達(dá)到99.59%，僅有少量氨基酸存在差異。將PpMADS1與番茄中已被證明對類胡蘿卜素合成代謝有調(diào)控作用的基因SlMADS1[16](NP_001234380.1)、SlCMB1[15](XP_004237061.1)、SlMADS-RIN[13](NP_001234670.1)、SlFUL1[23](NP_001234173.2)、SlFYFL[17](AHG98096.1)、TAGL1[24](NP_001300859.1)、SlMBP15[14](NP_001352611.1)進(jìn)行同源分析，他們的同源性分別為43.95%、46.12%、44.50%、47.54%、46.55%、65.82%、38.64%。利用ClustalX及Genedoc軟件對PpMADS1氨基酸序列與其他6個物種的MADS蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PpMADS1蛋白的N端包含MADS轉(zhuǎn)錄因子家族共有的特征MADS結(jié)構(gòu)域，同時包含了Ⅰ(intervening)region、k(keratin-like)-box以及相似的C端結(jié)構(gòu)[25-26]，PpMADS1蛋白C端有含有植物AG-motif特征序列，這說明桃PpMADS1屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子AG亞族。

注：PpS：Prunus pseudocerasus. Ps: Prunus serotina. Kj: Kerria japonica. Ppy: Pyrus pyrifolia; Pxb: Pyrus x brets chn eideri. Md: Malus domestica.

2.4 PpMADS1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析蛋白

為進(jìn)一步研究桃PpMADS1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，用NJ法分析了與其同源性較高的扁桃、中國櫻桃、烏梅、蘋果、歐洲櫻桃、野黑櫻桃、白梨、東京櫻花、粳稻、沙梨相關(guān)MADS家族基因的進(jìn)化關(guān)系。由圖5可知，與PpMADS1蛋白親緣關(guān)系較近的是扁桃、東京櫻花和中國櫻桃。同為李屬的扁桃、烏梅、歐洲櫻桃、野黑櫻桃、中國櫻桃、東京櫻花聚為一類，粳稻、蘋果、沙梨和白梨聚于一類，表明不同植物間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有明顯的種屬特征。

圖5 PpMADS1基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 PpMADS1時空表達(dá)分析

PpMADS1基因在金麗和湖景不同組織中的表達(dá)模式一致，即PpMADS1在芽、葉中幾乎不表達(dá)，在花和果實中大量表達(dá)，湖景花中PpMADS1表達(dá)量顯著高于金麗，金麗軟核和硬核果實中PpMADS1表達(dá)量都顯著高于湖景(圖6)。在2個品種桃果實成熟過程中PpMADS1表達(dá)量整體呈下降趨勢；成熟度S1時期，金麗果實中PpMADS1表達(dá)量顯著高于湖景；成熟度S2時期，湖景果實中PpMADS1表達(dá)量顯著高于金麗；成熟后期(S4～S5),湖景果實中PpMADS1表達(dá)量都顯著低于金麗果實(圖7)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

圖7 不同成熟度果實中PpMADS1基因的表達(dá)

2.6 PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子對PpPSY和PpCHYB基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性

利用同源重組方法將PpPSY和PpCHYB基因啟動子融合LUC報告基因，將PpMADS1融合62-sk效應(yīng)基因(圖8-A)。雙熒光素酶試驗結(jié)果如圖8-B所示，與空載體相比，PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子顯著提高了PpPSY和PpCHYB啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05)，說明PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子對PpPSY和PpCHYB啟動子具有轉(zhuǎn)錄激活作用。

注：A: 載體構(gòu)建原理圖；B: PpMADS1對PpPSY、PpCHYB啟動子的調(diào)控作用。

3 討論

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族是目前在植物領(lǐng)域研究最廣泛的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，調(diào)控著植物的營養(yǎng)生長和生殖生長過程，在果實成熟與品質(zhì)調(diào)控方面具有顯著作用[27]。本研究從桃果實中克隆得到一個桃MADS-box基因，將其命名為PpMADS1。MADS-box家族不同成員基因具有相對保守的序列，蛋白結(jié)構(gòu)存在相似性。生物信息學(xué)分析表明，PpMADS1編碼蛋白呈堿性，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲及三級結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)折疊的空間構(gòu)象具有較高的保守性，具有較好的脂溶性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，且為親水蛋白，PpMADS1蛋白特征與其他植物MADS基因家族的研究結(jié)果基本一致[28]。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示PpMADS1定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄因子特征。同源性分析表明，不同物種來源的MADS-box蛋白具有較高同源性，其中桃PpMADS1與扁桃、烏梅、中國櫻桃、東京櫻花等李屬MADS-box蛋白相似性較高。

在模式植物番茄中研究發(fā)現(xiàn)果實成熟過程中類胡蘿卜素的積累是由多個MADS-box轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控，包括正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子TAGL1、SlMADS-RIN、SlMBP15、SlCMB1以及負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SlMADS1、SlFYFL和SlMBP8[12-18]。在這些番茄MADS-box轉(zhuǎn)錄因子中，桃PpMADS1與TAGL1序列相似度最高，達(dá)65.82%；PpMADS1與TAGL1氨基酸序列上都含有AG亞族特有的典型基序，因此都屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子AG亞族[29]；在不同組織中，PpMADS1與TAGL1基因在芽、葉中幾乎不表達(dá)[12]，在花和果實中大量表達(dá)；且成熟后期黃肉桃金麗果實比白肉桃湖景有更高的PpMADS1表達(dá)水平，這與Cao等[20]報道黃肉桃金麗果實含有更高類胡蘿卜素含量相一致，上述結(jié)果暗示PpMADS1可能具有與TAGL1相似的基因功能，即可能也對果實類胡蘿卜素的積累起正調(diào)控作用。八氫番茄紅素合成酶PSY被認(rèn)為是類胡蘿卜素合成的限速酶[30]。番茄果實中PSY基因超量表達(dá)可有效促進(jìn)果實類胡蘿卜素的積累[31]。TAGL1轉(zhuǎn)錄因子正是通過上調(diào)PSY1和PDS表達(dá)水平，促進(jìn)番茄果實類胡蘿卜素的積累[12]。董新甜等[21]研究發(fā)現(xiàn)套袋和不套袋桃果肉間PpCHYB基因的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致兩種果實類胡蘿卜素含量差異的重要原因。Cao等[20]報道黃肉桃金麗果實采后貯藏期間類胡蘿卜素積累與PpPSY和PpCHYB基因的高表達(dá)密切相關(guān)。這些結(jié)果表明PpPSY和PpCHYB是黃肉桃果實類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因。在此基礎(chǔ)上，本研究通過雙熒光素酶試驗發(fā)現(xiàn)，PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子對PpPSY和PpCHYB基因啟動子具有轉(zhuǎn)錄激活作用，進(jìn)一步驗證了PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控PpPSY和PpCHYB基因表達(dá)促進(jìn)桃果實類胡蘿卜素合成。但PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控桃果實類胡蘿卜素合成與積累的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究從金麗和湖景2個品種桃果實中克隆得到PpMADS1的ORF序列，長度為732 bp，編碼243個氨基酸。生物信息學(xué)分析表明PpMADS1蛋白可能為堿性，具有較好的脂溶性，不穩(wěn)定，表現(xiàn)出親水性，定位于細(xì)胞核。PpMADS1與烏梅的氨基酸序列相似率最高，達(dá)到100%，氨基酸序列具有典型的MADS家族特征結(jié)構(gòu)域及AG亞族特種基序，屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族AG亞族基因。qRT-PCR和雙熒光素酶試驗結(jié)果表明，PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控PpPSY和PpCHYB基因表達(dá)促進(jìn)桃果實類胡蘿卜素合成。本研究為進(jìn)一步揭示PpMADS1轉(zhuǎn)錄因子在果實成熟過程中調(diào)控類胡蘿卜素合成代謝的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。