茶菊病毒檢測與脫除技術(shù)研究

吳 茜 蔡曉霖 管志勇 朱 波 易 利 鄭永生 鄧邦清 蔣甲福,*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點實驗室，江蘇 南京 210095；2 麻城市菊花協(xié)會，湖北 麻城 438300)

菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于中國，栽培歷史已達(dá)3 000多年，在古代亦被稱為鞠、黃花、節(jié)花、金蕊、壽客等。菊花具有廣泛的用途，除了有極高的觀賞價值外，清香甘甜的茶用菊還具有較好的食用和藥用價值[1]。近年來隨著茶用菊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，各地茶用菊種植面積不斷擴大，加之菊農(nóng)長期分散留種、缺乏優(yōu)選種株的習(xí)慣，長期扦插繁殖方式使感染的病毒在種株上不斷積累，導(dǎo)致各地茶用菊出現(xiàn)了明顯的品質(zhì)劣變、產(chǎn)量降低等種性退化的現(xiàn)象，制約了茶用菊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前世界上已報道的能夠侵染菊花的(類)病毒大約有20余種，而在中國地區(qū)報道過的菊花(類)病毒有8種，分別為菊花B病毒(ChrysanthemumvirusB，CVB)、黃瓜花葉病毒(Cucumbbermosaicvirus，CMV)、煙草花葉病毒(Tomatoaspermyvirus，TAV)、番茄不孕病毒(Tomatoaspermyvirus，TAV)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)6種病毒和菊花矮化類病毒(Chrysanthemumstuntviroid，CSVd)、菊花褪綠斑駁類病毒(Chrysanthemumchloriticmottleviroid，CChMVd)2種類病毒[2]，其中相當(dāng)一部分的菊花病毒病屬于檢疫性病害，會大面積擴散傳播。因此，對我國茶用菊感染病毒狀況的了解尤為重要。運用快速有效的檢測方法確定茶用菊感染的病毒種類，并對染病植株進(jìn)行脫毒，使其得到復(fù)壯，改善種性退化問題，是解決菊花病毒侵染造成產(chǎn)量和品質(zhì)低下的關(guān)鍵。

福白菊原產(chǎn)地為湖北省麻城市福田河鎮(zhèn)、黃土崗鎮(zhèn)等地，已有300余年的種植歷史[3]，因其花瓣白凈、湯色清亮、芳香甘甜，被譽為茶用菊中的上品。福白菊在麻城常年種植面積達(dá)5萬畝，年產(chǎn)量5 000 t以上，產(chǎn)值突破2億元，給當(dāng)?shù)胤N植農(nóng)戶帶來了可觀的經(jīng)濟效益[3]。近年，福白菊產(chǎn)區(qū)已出現(xiàn)普遍的種性退化現(xiàn)象，而福白菊脫毒工作及福白菊脫毒苗在生產(chǎn)上的使用鮮見報道。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于品種脫毒，還可以在短期內(nèi)擴繁獲得大量無性系植株[4]，近年來越來越多地應(yīng)用于菊花快繁[5]。其中，莖尖培養(yǎng)作為植物首選的脫毒技術(shù)常與化學(xué)藥劑、高溫或低溫處理結(jié)合用于種苗脫毒[6]。莖尖再生效率直接影響脫毒的效率。激素的種類與濃度對外植體形成愈傷組織和芽的誘導(dǎo)效果不同，激素配比不當(dāng)可能會引起愈傷組織褐化、不定芽玻璃化、脫毒苗生根困難等問題[5]，而細(xì)胞分裂素和生長素是植物組織培養(yǎng)中較常用的激素，這兩種激素在調(diào)控植物組織分裂分化中起著協(xié)同作用[7]。

本研究旨在篩查茶用菊品種的染毒情況，并在前期工作[8-9]基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)基中不同的激素組合配比，以分析對福白菊莖尖培養(yǎng)脫毒再生效果的影響，同時分析和比較福白菊脫毒苗和非脫毒苗在遺傳穩(wěn)定性、產(chǎn)量和品質(zhì)等方面的表現(xiàn)，以期為在生產(chǎn)上推行以福白菊等為代表的茶用菊脫毒苗提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心收集保存的24個常見茶用菊品種，取樣地點為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江寧湖熟菊花基地。

表1 供試茶用菊品種

1.2 試驗方法

1.2.1 巢式PCR病毒檢測 根據(jù)GenBank記錄的中國地區(qū)侵染菊花的8種(類)病毒基因序列，即菊花B病毒(CVB)、馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、番茄不孕病毒(TAV)6種病毒，以及菊花矮化類病毒(CSVd)、菊花褪綠斑駁類病毒(CChMVd)2種類病毒，利用Primer Premier 5.0軟件分別對其設(shè)計巢式PCR引物各2對。參照Coy等[10]建立的方法進(jìn)行巢式PCR病毒檢測，目的條帶切膠送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.2 莖尖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基篩選 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置5組不同激素配方，在每種激素配方上各接種15個福白菊莖尖(重復(fù)2次)，統(tǒng)計莖尖出愈率，篩選最適合莖尖生長的激素配方。激素配方為：6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA，0 mg·L-1)+萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid，NAA，0 mg·L-1)；6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)；6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)；6-BA(2.0 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)；6-BA(2.0 mg·L-1)+NAA(0.5 mg·L-1)。

1.2.3 低溫處理結(jié)合利巴韋林脫毒 參照文獻(xiàn)[8-9，11]，在篩選出來的最適莖尖生長的培養(yǎng)基中添加利巴韋林至終濃度為10 mg·L-1。將4℃低溫處理3個月的福白菊無菌組培苗在M60體視顯微鏡(德國Leica公司)下剝?nèi)〈笮?.3～0.5 mm并莖尖分生組織，置于添加10 mg·L-1利巴韋林的培養(yǎng)基中，于組培室培養(yǎng)(組培室光照時間為16 h·d-1，光強為36 μmol·m-2·s-1)。

1.2.4 脫毒苗脫毒效果檢測及擴繁 當(dāng)福白菊脫毒苗生長高度達(dá)到5～7 cm后取1～2片葉用于提取RNA，并進(jìn)行脫毒效果檢測?？俁NA的提取按照日本TaKaRa公司提供的RNAiso Plus試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA的合成參照試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit, 日本TaKaRa公司)的說明書進(jìn)行；將巢式PCR驗證脫毒成功的脫毒苗進(jìn)行擴繁，切取1～2 cm嫩梢接入MS生根培養(yǎng)基中，在溫度25℃、光照強度36 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)15～20 d后可長出新根。

1.2.5 脫毒苗遺傳穩(wěn)定性分析 分別隨機選取3株脫毒苗及未經(jīng)脫毒處理的組培苗作為遺傳穩(wěn)定性檢測材料，參照吳洋洋等[12]的方法利用相關(guān)序列擴增多態(tài)性標(biāo)記系統(tǒng)(sequence related amplified polymorphism，SRAP)進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。

1.2.6 脫毒苗與非脫毒苗生長指標(biāo)、產(chǎn)量與品質(zhì)分析 分別以脫毒種株和非脫毒種株為扦插采穗母本，4月下旬扦插，扦插苗生根后，5月上旬定植，株距7 cm。參照于云霞等[13]的方法測定形態(tài)指標(biāo)。

株高：用卷尺測量莖基部至頂端的垂直高度，記錄數(shù)據(jù)(單位：cm)；

冠幅：用卷尺測量整個植株的冠幅，記錄數(shù)據(jù)(單位：cm)；

單葉鮮重：用PL602-L電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)測量株高25 cm處單個葉片的鮮重，記錄數(shù)據(jù)(單位：g)；

單葉面積：用Perfection V750 Pro根系掃描儀(日本Epson公司)測量單個葉片的葉面積，記錄數(shù)據(jù)(單位：mm2)；

葉綠素含量：用FMS2便攜式葉綠素?zé)晒鈨x (英國Hansatech公司)測定植株上、中、下3個部分葉片的葉綠素含量，計算取平均值，記錄數(shù)據(jù)(單位：SPAD);

單株花數(shù)：隨機選3株，采用人工計數(shù)的方式，分別計數(shù)單個植株一、二、三茬花數(shù)，累加計算平均數(shù)，記錄數(shù)據(jù)(單位：個)；

單株產(chǎn)量：用PL602-L電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)分別稱量單個植株一、二、三茬花的鮮重，累加，記錄數(shù)據(jù)(單位：g)。

總黃酮含量：參照舒俊生等[14]建立乙醇超聲波提取總黃酮方法，選用Lambda 25紫外分光光度計(美國PE公司)測定其含量。

綠原酸、木樨草苷及3,5-O-雙咖啡?；鼘幩?又稱異綠原酸A)的提取與含量測定：參考2015年版《中華人民共和國藥典》中的測定方法，選用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)(Infinity 1260，美國Agilent公司)進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用齊軍山等[15]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計與整理，檢測數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性后進(jìn)行單因素ANOVA方差分析和差異性顯著分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶用菊病毒病害調(diào)查

利用巢式PCR對24種茶用菊染病情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明茶用菊感染了CVB、TAV、CSVd和CChMVd這4種(類)病毒，而另外4種病毒PVX、PVY、CMV、TMV未檢測到條帶。在這24種茶用菊中，感染率最高的為CSVd，感染率高達(dá)100%，其次是TAV，其感染率為91.67%，CVB的感染率為87.50%，CChMVd的感染率為66.67%(表2、圖1)。

表2 供試茶用菊樣品染病情況

圖1 感染病毒情況統(tǒng)計

2.2 福白菊的病毒病害表型考察及單株病毒檢測

產(chǎn)區(qū)田間種植的福白菊出現(xiàn)了產(chǎn)量降低、品質(zhì)劣變等種性退化現(xiàn)象(圖2)，福白菊單株取樣的病毒檢測發(fā)現(xiàn)CSVd、CVB 2種引物能夠擴增出明顯的目的條帶，而其他6種病毒引物均無目的條帶。CSVd、CVB巢式PCR第二輪產(chǎn)物大小分別為163、381 bp(圖3)。將目的條帶割膠純化，送至南京擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明，CVB的擴增片段與GenBank中對應(yīng)序列(EU499736.1)的核苷酸序列同源性達(dá)到91%，CSVd的擴增片段與對應(yīng)序列AB279771.1的核苷酸序列同源性為100%，確定福白菊感染了CSVd。

注：a：健康植株；b：感病植株。

Note: M: Marker DL 2 000. 1～8: CSVd、CChMVd、CVB、TAV、PVY、PVX、TMV、CMV.

2.3 福白菊莖尖最適培養(yǎng)基的確定及脫毒培養(yǎng)

由表3可知，不同濃度、比例的植物激素(6-BA/NAA)對福白菊莖尖的誘導(dǎo)效率不同。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.1 mg·L-1時，福白菊的莖尖誘導(dǎo)存活率最高，達(dá)到了60%，未添加植物激素的MS培養(yǎng)基上的莖尖生長較為緩慢且長勢較弱；當(dāng)6-BA/NAA 為2.0/0.1或2.0/0.5時，部分莖尖形成的愈傷組織分化較慢，且培養(yǎng)后期出現(xiàn)玻璃化、褐化等現(xiàn)象，幼苗較瘦弱，生長狀況明顯弱于其他濃度比例處理的幼苗(圖4)。本試驗處理中福白菊莖尖分生組織誘導(dǎo)培養(yǎng)最適宜的激素配比為6-BA/NAA為1.0/0.1 mg·L-1。

表3 福白菊莖尖在不同濃度植物激素下的誘導(dǎo)存活率

圖4 不同濃度植物激素誘導(dǎo)福白菊莖尖的生長過程

基于激素配比篩選結(jié)果，用解剖針剝?nèi)?℃低溫培養(yǎng)3個月的福白菊組培苗0.3～0.5 mm的莖尖分生組織，接種至利巴韋林終濃度為10 mg·L-1的MS + 6-BA/NAA(1.0/0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基中。圖5為福白菊莖尖分生組織培養(yǎng)1、7、14 d不同階段的生長狀態(tài)，當(dāng)帶1～2片葉原基的莖尖分生組織(圖5-a)接種到培養(yǎng)基中一周后轉(zhuǎn)綠，逐漸形成膨大的葉原基(圖5-b)；莖尖接種14 d后，葉原基生長形成帶有芽點的嫩芽(圖5-c)，并在后期繼續(xù)生長逐漸分化成苗。

注：a: 莖尖分生組織(1 d)；b: 初始形成的小芽(7 d)；c: 莖尖分化成苗(14 d)。

2.4 脫毒效果檢測及脫毒苗的遺傳穩(wěn)定性分析

運用巢式PCR方法對福白菊的脫毒效果進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示。電泳圖上無特異性條帶則說明脫毒成功，有條帶則說明未脫毒成功(反應(yīng)產(chǎn)物則呈現(xiàn)陽性反應(yīng))。結(jié)果顯示，1號、2號福白菊組培苗成功脫除CSVd和CVB。

注：a: M: Marker. +: 陽性對照；-: 陰性對照；1和2：CSVd脫毒成功；3和4：CSVd脫毒未成功。b:M: Marker. +: 陽性對照；-: 陰性對照；1和2：CVB脫毒成功；3和4：CVB脫毒未成功。

前期通過預(yù)試驗，篩選到16對多態(tài)性良好、條帶清晰的SRAP引物組合。利用篩選到的引物對福白菊脫毒苗及未脫毒苗進(jìn)行SRAP-PCR擴增，由圖7可知，脫毒苗在DNA水平上未檢測到遺傳變異，表明4℃低溫處理及利巴韋林的添加對福白菊的遺傳穩(wěn)定性無影響。

2.5 福白菊脫毒苗與非脫毒苗產(chǎn)量和品質(zhì)的比較

由表4可知，來自福白菊脫毒種株的生產(chǎn)苗(以下簡稱脫毒苗)大田表現(xiàn)為株高略矮，冠幅較大；脫毒苗較非脫毒苗大田表現(xiàn)為更加矮壯，不易倒伏，且脫毒苗的單葉鮮重和單葉面積、葉綠素含量較非脫毒苗都有顯著提高。葉面積及葉綠素含量的增加有助于脫毒苗提高光合效率，積累更多光合作用產(chǎn)物。就產(chǎn)量而言，脫毒苗的平均單株花數(shù)較多，平均單株產(chǎn)量較組培苗高14.47%(表5)，其估算畝產(chǎn)量也顯著高于未脫毒苗；在內(nèi)含物的含量上，脫毒苗的總黃酮含量達(dá)199.67 mg·g-1，而綠原酸和木犀草苷含量較未脫毒苗也有顯著提高(表6)。

表4 不同種苗對福白菊生長的影響

表5 不同種苗對產(chǎn)量的影響

表6 不同種苗植株內(nèi)含物的含量

3 討論

菊花作為我國傳統(tǒng)名花有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，但在菊花生產(chǎn)中病毒病害十分嚴(yán)重，已造成嚴(yán)重危害[16-17]。檢測植物病毒的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[18-19]等。隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)展，巢式PCR也逐步應(yīng)用到植物病毒檢測領(lǐng)域。本研究通過巢式PCR檢測方法調(diào)查了田間茶用菊病毒病害的感染情況，檢測出了TAV和CVB 2種病毒，以及CChMVd和CSVd 2種類病毒，而其他4種病毒PVX、PVY、TMV、CMV未檢出，可能由于病毒系統(tǒng)間存在交叉保護作用或干涉作用，即當(dāng)植物被一種病毒侵染，則其同類或近緣病毒就不再感染[20]。本研究確定了茶用菊病毒病害的主要病毒種類，所用巢式PCR方法，靈敏、快速、有效，可以作為田間病毒病害早期診斷以及動態(tài)檢測病毒感染、防控病毒的首選方法。通過巢式PCR及后續(xù)的BLAST序列比對確定了福白菊感染了CSVd類病毒和CVB病毒，并在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)菊花課題組前期工作的基礎(chǔ)上確定誘導(dǎo)莖尖培養(yǎng)最適合的6-BA和NAA濃度分別為1和0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)存活率較文獻(xiàn)[8-9]的研究結(jié)果高6.7個百分點，優(yōu)化了脫毒效率。

研究表明，在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織分化出不定芽的過程中植株容易產(chǎn)生無性系變異[21]，而保持脫毒對象的優(yōu)良種性直接決定了脫毒種苗能否進(jìn)行商業(yè)推廣。SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡便、高效、高共顯性、重復(fù)性好等優(yōu)點，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)能夠快速對脫毒苗和非脫毒苗之間遺傳位點的差異進(jìn)行高分辨率的鑒別比較[22]。本研究利用前期篩選的16對SRAP引物對福白菊脫毒苗和未脫毒處理組培苗進(jìn)行SRAP-PCR擴增，未出現(xiàn)任何大小、亮度有差異的條帶，表明脫毒處理對福白菊的遺傳穩(wěn)定性未產(chǎn)生影響。

由病毒侵染引起的植物病害在全球范圍內(nèi)造成極大的損失[23]，且單一植株可能同時被多種病毒侵染[24]，導(dǎo)致植株產(chǎn)量、質(zhì)量的下降，脫毒技術(shù)的出現(xiàn)改善了無性繁殖產(chǎn)生的病毒侵染問題[25]。有文獻(xiàn)報道脫毒處理可以顯著提高植物的產(chǎn)量，脫毒的懷菊株系YD5J6與非脫毒的株系相比增產(chǎn)25.17%[26]；脫毒后的滁菊單株產(chǎn)量較非脫毒苗高24.0%[8-9]。周穎媛[27]在懷菊的大田試驗結(jié)果也表明脫毒株系的單株鮮重、單株花數(shù)及單株分蘗數(shù)均有所增加，其中脫毒株系與其對照株系相比，畝產(chǎn)增加16.4%。本試驗中，福白菊脫毒苗在單葉鮮重、單葉面積、葉綠素含量均優(yōu)于非脫毒苗，脫毒苗單株產(chǎn)量較非脫毒苗高14.47%，表明福白菊脫毒后種源得到復(fù)壯，葉綠素水平上升即光合機構(gòu)的基礎(chǔ)優(yōu)于非脫毒苗，是其產(chǎn)量提高的原因之一。本試驗中，單株著花量及估算畝產(chǎn)量也得到脫毒苗推廣區(qū)大田數(shù)據(jù)的支持。

經(jīng)過脫毒處理之后，藥用植物中有效成分的含量也得到了改善和提高。研究表明，脫毒后的懷地黃中的藥用成分梓醇含量較非脫毒苗提高32.90%[28]；脫毒后亳菊的總黃酮、綠原酸等含量都有顯著提升[29]；杭白菊脫毒苗中的綠原酸含量高于藥典中規(guī)定的0.2%[30]。本試驗結(jié)果表明，福白菊脫毒苗的總黃酮、綠原酸、木犀草苷3種花朵活性成分均高于非脫毒苗。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了24個茶用菊感染病毒情況，確定了感染較為普遍的4種優(yōu)勢病毒和類病毒，結(jié)果表明，所用檢測方法巢式PCR 靈敏高效，可應(yīng)用于之后的菊花病毒病害診斷，為這菊花病毒病的檢測奠定了基礎(chǔ)。對感染病毒病嚴(yán)重的福白菊進(jìn)行了脫毒處理，明確了其莖尖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基，優(yōu)化了脫毒效率。茶菊病毒檢測和病毒脫除操作規(guī)程如下：

1)對田間疑似感染病毒的茶用菊使用病毒檢測引物進(jìn)行PCR確定感染病毒種類；2)對感染病毒植株進(jìn)行外植體消毒獲得無菌組培苗，并4℃低溫培養(yǎng)3個月；3)在體視顯微鏡下剝?nèi)∏o尖長度為0.3～0.5 mm的莖尖分生組織，置于含有1.0 mg·L-16-BA、0.1 mg·L-1NAA、10 mg·L-1利巴韋林的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；4)對脫毒苗再次進(jìn)行病毒檢測，將脫毒成功的單株進(jìn)行擴繁；5)待脫毒苗生根后煉苗，移栽大田。

通過對脫毒苗和非脫毒苗一些生長指標(biāo)(株高、冠幅、產(chǎn)量、鮮重等)以及內(nèi)含物(綠原酸、總黃酮、木犀草苷等)的測定，證明脫毒苗的品質(zhì)、產(chǎn)量都有一定的提高，說明用脫毒種株的種苗進(jìn)行生產(chǎn)可以達(dá)到高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的雙重目的。