利用GFP基因的黃瓜T-DNA插入突變體構(gòu)建與快速鑒定

馮路路 王雪艷 夏 磊 王團(tuán)團(tuán) 李 季，* 陳勁楓

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095；2江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 南通 226541)

黃瓜(CucumissativusL.)是一種重要的蔬菜作物，其栽培歷史悠久[1]。近年來，隨著黃瓜基因組測序的完成及基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的重要功能基因被定位并克隆出來，發(fā)現(xiàn)新基因和發(fā)掘基因功能已經(jīng)成為黃瓜功能基因組學(xué)研究的重要任務(wù)[2]。突變體是研究基因功能最直接、最有效的試驗材料之一，相較于野生型植株，突變體往往僅在某一個基因位點發(fā)生變化，避免了其他位點的干擾[3]，對基因功能研究具有重要價值。由于黃瓜的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄[4]，自然變異的頻率很低，因此，人為創(chuàng)制突變體進(jìn)行基因功能研究已成為必然。

突變體的創(chuàng)制途徑主要包括物理誘變、化學(xué)誘變及插入突變等，近年來的基因編輯技術(shù)作為一種定向創(chuàng)制突變體的方法已廣泛應(yīng)用于番茄(SolanumlyeopersicumMill.)[5]、水稻(OryzasativaL.)[6]及擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]中，黃瓜中也有相應(yīng)報道。其中，插入突變具有研究無表型基因、易獲得突變位點、易于進(jìn)行反向遺傳學(xué)研究等諸多優(yōu)點[8]，是一種較為適合創(chuàng)制植物突變體的方法。隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展，T-DNA插入破壞基因廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究[9]。目前，利用T-DNA插入創(chuàng)制突變體的方法已經(jīng)成功應(yīng)用于構(gòu)建擬南芥[10]和水稻[11]突變體庫，并對相關(guān)突變體的突變基因功能進(jìn)行了分析，明確了花青素[12]、穗形態(tài)[13]以及葉片夾角[14]等農(nóng)藝性狀相關(guān)的重要基因。前人多是利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulphonat, EMS)來創(chuàng)制黃瓜突變體，如王晶等[15]利用EMS誘變獲得了有關(guān)株型、葉片、花器官以及果實性狀的黃瓜突變體；薛紅霞等[16]利用EMS誘變得到了葉型、葉色、果實長度、株型等多個類型的黃瓜突變體。在葫蘆科插入突變體創(chuàng)制方面，任海英等[17]利用T-DNA插入突變得到一個蔓枯病抗性明顯增強(qiáng)的甜瓜突變體edr2。李蕾等[18]將T-DNA插入應(yīng)用于黃瓜突變體構(gòu)建中，并利用PCR和斑點雜交技術(shù)對T-DNA插入突變體進(jìn)行了驗證。Hu等[19]通過基因編輯技術(shù)敲除了黃瓜中的CsWIP1基因，該基因的突變使黃瓜植株由雌雄同株轉(zhuǎn)變?yōu)槿浦?，并在轉(zhuǎn)基因后代中篩選得到非轉(zhuǎn)基因的純合突變體Cswip1。

利用T-DNA插入的方法創(chuàng)制突變體往往需要高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。Trulson等[20]早在1986年就首次成功獲得黃瓜轉(zhuǎn)基因材料，在過去三十多年中，研究者對黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化方案進(jìn)行了基因型[21]、外植體[22]、選擇標(biāo)記[23]等多方面的優(yōu)化，但目前的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系依舊存在著轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性差等問題。本研究在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室已經(jīng)建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，從農(nóng)桿菌活力、共培養(yǎng)溫度等方面進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)報告基因為插入基因，利用TAIL-PCR進(jìn)行T-DNA插入突變體的T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，確定T-DNA的插入位點，對插入基因的功能進(jìn)行初步解析，以期得到更高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為黃瓜功能基因組學(xué)研究提供一定的技術(shù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于遺傳轉(zhuǎn)化的黃瓜材料為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室保存的長春密刺高代自交系CCMC。農(nóng)桿菌菌株C58、表達(dá)載體pGreen0029均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室提供。DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek_安諾倫(北京)生物科技有限公司，Genome Walking Kit試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。植物組培材料在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃，光周期16 h/8 h (晝/夜)。再生植株在人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28℃/25℃ (晝/夜)，光周期18 h/6 h (晝/夜)，相對濕度70%～75%。

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化方法 以CCMC為受體材料，選取飽滿的種子進(jìn)行消毒，接種到無菌培養(yǎng)基上。待種子生長至下胚軸直立子葉未張開的狀態(tài)，將植株生長點剔除后，保留1/3子葉和2 mm下胚軸的子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基[MS + 6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)1.5 mg·L-1) + 脫落酸(abscisic acid，ABA)0.2 mg·L-1]上，黑暗條件下培養(yǎng)1 d。

挑取攜帶植物表達(dá)載體pGreen0029的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)，之后將其制備成OD600為0.5的侵染液。將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的外植體置于農(nóng)桿菌重懸液中侵染20 min，然后將侵染完成的外植體置于共培養(yǎng)基(MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ ABA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)100 μmol·L-1]上黑暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基[MS + 6-BA 1.5 mg·L-1+ ABA 0.2 mg·L-1+ Kan(卡那霉素)100 mg·L-1+ 特美汀(timentin, TM)200 mg·L-1]上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 農(nóng)桿菌生長曲線的測定 取剛活化好的菌液400 μL加入50 mL配置好的液體YEB培養(yǎng)基中在28℃重新?lián)u菌，在24 h內(nèi)每隔2 h吸取10 μL不同稀釋程度的菌液接種于配置好的YEB固體培養(yǎng)基中，28℃倒置避光培養(yǎng)30 h，然后對培養(yǎng)基上長出的農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)得到各個時間段單位菌液中的活細(xì)菌數(shù)量并測定其OD600值，并制作農(nóng)桿菌的生長曲線。

1.2.3 共培養(yǎng)溫度處理對轉(zhuǎn)化效率的影響 農(nóng)桿菌侵染操作方法同1.2.1，將侵染完成的外植體接種于共培養(yǎng)基上分別在18、23、28、33℃條件下黑暗培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后對外植體進(jìn)行熒光觀察，統(tǒng)計不同溫度條件下的外植體的再生率以及轉(zhuǎn)化率，重復(fù)3次。

1.2.4 利用GFP報告基因篩選轉(zhuǎn)化外植體 以pGreen0029載體為轉(zhuǎn)化載體，該載體的T-DNA插入序列為綠色熒光蛋白基因GFP的表達(dá)單元，因此當(dāng)T-DNA成功插入到植物宿主細(xì)胞中時，GFP可以作為報告基因，在外植體分化培養(yǎng)15 d左右進(jìn)行熒光觀察，將外植體置于MVX10宏觀變倍體式熒光顯微鏡下(日本Olympus公司)，在GFP通道(460～550 nm)下對外植體進(jìn)行熒光觀察。未轉(zhuǎn)化的外植體由于葉綠體自發(fā)熒光而顯現(xiàn)為紅色，被轉(zhuǎn)化的外植體由于會表達(dá)GFP則顯現(xiàn)為綠色。為了準(zhǔn)確評估轉(zhuǎn)化事件，將整體表達(dá)GFP信號的愈傷組織或再生芽認(rèn)定為陽性愈傷或陽性芽，愈傷組織或再生芽上僅分散有GFP表達(dá)細(xì)胞的不能認(rèn)定為陽性愈傷或陽性芽。

1.2.5 利用GFP報告基因鑒定轉(zhuǎn)化植株 將篩選得到的外植體經(jīng)過分化、伸長、生根后進(jìn)行馴化，待植株生長健壯后取轉(zhuǎn)化植株的葉片、卷須、花芽以及根系等部位置于MVX10宏觀變倍體式熒光顯微鏡下，在GFP通道(460～550 nm)下進(jìn)行GFP信號的表達(dá)觀察。并將轉(zhuǎn)化植株置于植物活體成像系統(tǒng)中，對轉(zhuǎn)化植株整體的GFP熒光表達(dá)情況進(jìn)行觀察鑒定。

1.2.6 TAIL-PCR克隆T-DNA側(cè)翼序列 DNA試劑盒[安諾倫(北京)生物科技有限公司]提取已經(jīng)馴化的一株T-DNA插入黃瓜突變體和野生型黃瓜幼嫩葉片的總DNA，具體步驟參考產(chǎn)品說明書。利用Premier 5.0軟件在T-DNA右邊界設(shè)計3個巢式引物SP1、SP2和SP3(表1)，引物AP1、AP2是由Genome Walking Kit試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]提供的經(jīng)過特別設(shè)計的退火溫度較低的兼并引物。按照試劑盒說明對黃瓜T-DNA插入突變體的T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，將第三輪PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后送往南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)網(wǎng)站進(jìn)行序列比對分析。根據(jù)得到的插入位點，在T-DNA載體序列中設(shè)計特異性引物M-F，在插入位點旁臨的基因組序列中設(shè)計特異性引物M-R，利用這對特異性引物對突變體進(jìn)行鑒定。

表1 試驗所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的體系中，農(nóng)桿菌自身活力是影響侵染成功率的關(guān)鍵因素。細(xì)菌培養(yǎng)增殖有四個時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，處于對數(shù)期的細(xì)菌具有更好的活力[24]。農(nóng)桿菌活力鑒定通常采用OD值法，但該方法測定的菌液濃度同時包含了活菌和死亡菌，不能準(zhǔn)確地反映農(nóng)桿菌的真實活力，本研究通過測定農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)過程中不同時間點單位菌液中的活菌數(shù)目(CFU·mL-1)，制作農(nóng)桿菌生長曲線。由圖1可知，農(nóng)桿菌活化8～20 h，菌群處于對數(shù)生長期；20 h之后，雖然OD值仍在上升， 但活菌統(tǒng)計顯示菌群已進(jìn)入衰亡期。綜合菌群活力和菌體數(shù)量，本研究認(rèn)為農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)12～18 h時，菌液具有最佳的活力。

圖1 農(nóng)桿菌生長曲線圖

共培養(yǎng)階段是農(nóng)桿菌完成對植物細(xì)胞侵染的時期，共培養(yǎng)階段的溫度、時間、培養(yǎng)基成分以及pH值都是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素[25]。本研究對不同共培養(yǎng)溫度處理轉(zhuǎn)化外植體2周后統(tǒng)計其再生率和陽性誘導(dǎo)率，由表2可知，只有共培養(yǎng)溫度為33℃時外植體再生率最低，僅為21.29%，顯著低于其他溫度條件下培養(yǎng)的外植體，說明共培養(yǎng)階段高溫會抑制外植體的分化。28℃是最適宜農(nóng)桿菌生長的溫度，但陽性誘導(dǎo)率的統(tǒng)計結(jié)果顯示，當(dāng)共培養(yǎng)溫度為23℃時陽性誘導(dǎo)率最高為2.26%，顯著高于28℃下的轉(zhuǎn)化率。綜合外植體的再生率和陽性誘導(dǎo)率，本研究認(rèn)為23℃是最適的共培養(yǎng)溫度。

表2 共培養(yǎng)溫度對黃瓜子葉節(jié)轉(zhuǎn)化的影響

2.2 利用綠色熒光蛋白GFP的突變體快速鑒定

在外植體侵染完成后分化培養(yǎng)2周，統(tǒng)計外植體的分化率并進(jìn)行GFP熒光觀察。觀察結(jié)果顯示，綠色熒光在不同類型的組織中均有表達(dá)。白色且質(zhì)地松散的非胚性愈傷組織中，GFP信號較弱，僅在愈傷表面呈松散分布(圖2-A、E)；在綠色的質(zhì)地較為致密的愈傷組織中，GFP信號較為集中地分布在愈傷突起部位(圖2-B、F)，這類愈傷再生率較高；在再生芽中，熒光信號分布也有不同表現(xiàn)，例如在嵌合體的再生芽中，成功轉(zhuǎn)化的組織部位可以清晰檢測到熒光信號，而未轉(zhuǎn)化部位無熒光信號(圖2-C、G)。相比之下，由轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)育而來的陽性再生芽，其各個組織部位均能檢測到較強(qiáng)的熒光信號(圖2-D、H)。在通過體式熒光顯微鏡的快速鑒定后，將具有較強(qiáng)熒光信號的胚性愈傷組織或再生芽的外植體繼續(xù)繼代培養(yǎng)，同時切去各熒光組織部位周圍的無熒光再生芽。

注：A、B、C和D分別是明場下的具有非胚性愈傷的外植體，具有胚性愈傷的外植體，轉(zhuǎn)基因嵌合體，具有陽性芽的外植體；E、F、G和H分別是具有非胚性愈傷的外植體，具有胚性愈傷的外植體, 轉(zhuǎn)基因嵌合體，具有陽性芽的外植體。

利用優(yōu)化后的遺傳轉(zhuǎn)化體系創(chuàng)制T-DNA插入突變體，通過GFP熒光表達(dá)的篩選，最終從2 978個黃瓜轉(zhuǎn)化子葉節(jié)外植體中得到3株GFP陽性植株，遺傳轉(zhuǎn)化率為1.00‰。將篩選得到的陽性外植體進(jìn)行馴化，待植株生長健壯后對植株的葉片、花芽、卷須以及根系等部位進(jìn)行GFP信號表達(dá)觀察，發(fā)現(xiàn)這些組織部位均有GFP信號的表達(dá)(圖3)。利用活體成像系統(tǒng)對整個植株進(jìn)行GFP熒光表達(dá)觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化植株整體均有不同程度的GFP熒光信號，其中，轉(zhuǎn)化植株的葉脈和生長點等組織部位熒光信號最強(qiáng)，為700 cps(counts per second)；嫩葉和卷須等組織部位熒光信號強(qiáng)度次之，為400 cps；衰老葉片和葉片邊緣等組織部位熒光信號強(qiáng)度最弱，為50 cps(圖4)。

注：A、B、C和D分別是明場下轉(zhuǎn)基因植株的葉片、花芽、卷須和根系；E、 F、G和H分別是轉(zhuǎn)基因植株的葉片、花芽、卷須和根系。

注:右側(cè)光標(biāo)顯示生物發(fā)光強(qiáng)度值范圍為 (紫色端) 50～1 800 cps (紅色端)。

2.3 突變體插入位點的分子鑒定

以未轉(zhuǎn)化長春密刺植株(圖5-A)為對照，對T0突變體T-DNA-PG-1(圖5-B)的株型、雄花、雌花以及葉片形態(tài)等性狀進(jìn)行比較觀察，結(jié)果顯示，T0植株與野生型植株相比無明顯差異。為檢測T-DNA插入突變體中T-DNA的插入位置，本研究采用TAIL-PCR對T-DNA插入突變體進(jìn)行T-DNA的側(cè)翼序列擴(kuò)增，分別利用Genome Walking Kit試劑盒中的簡并引物AP1、AP2和自行設(shè)計的序列特異性引物SP1、SP2、SP3對已經(jīng)馴化的1株T-DNA插入突變體的基因組DNA進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增，在使用簡并引物AP1的第三輪PCR擴(kuò)增結(jié)果中得到了一段大于2 000 bp的DNA片段(圖6-B)，然后將該第三輪PCR產(chǎn)物測序，得到736 bp的準(zhǔn)確DNA序列。利用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與載體序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果前160 bp的DNA序列中有112 bp的DNA序列與載體序列一致，然后將測序結(jié)果在葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/)網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，測序結(jié)果中位于193～704之間共512 bp的DNA片段與黃瓜基因組第一條染色體的20 011 698～20 011 187的DNA片段100%匹配，因此，初步將T-DNA插入突變體的T-DNA插入位置定位于第1條染色體上CsaV3_1G032940基因的第10個外顯子中，推測該基因是一類蛋白激酶。

注：A: 野生型植株；B: 突變體T-DNA-PG-1。

為了進(jìn)一步驗證TAIL-PCR的鑒定結(jié)果，在T-DNA載體上設(shè)計特異性引物M-F，距離T-DNA右邊界1 149 bp。然后在基因組中設(shè)計特異性引物M-R，距離T-DNA右邊界插入位點401 bp(圖6-A)。利用設(shè)計的這一對引物對黃瓜野生型植株和T-DNA插入突變體植株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。在黃瓜T-DNA插入突變體植株的DNA中，由于有T-DNA載體插入，可以擴(kuò)增出預(yù)期約1 550 bp的片段；而在野生型植株的DNA中，由于未插入T-DNA載體，不能擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA片段(圖6-C)。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增序列和預(yù)期的序列結(jié)果基本一致，進(jìn)一步確定了T-DNA插入突變體的T-DNA插入位置。

注：A: T-DNA在第一條染色體的插入位點；B: TAIL-PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)翼序列；C: T-DNA插入位點的驗證。M: DNA maker；1～3: 兼并引物AP1的第1、2、3輪TAIL-PCR擴(kuò)增；4～6: 兼并引物AP2的第1、2、3輪TAIL-PCR擴(kuò)增；7: 水；8: 野生型植株; 9、10: 轉(zhuǎn)基因植株。

3 討論

報告基因具有可靠、便捷和靈敏度高等優(yōu)點，是一種較為適合鑒定轉(zhuǎn)基因植株的方法，目前β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase，GUS)和GFP是黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系中應(yīng)用最為普遍的報告基因。GUS是一種廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因快速檢測的報告基因[26]，但GUS無法進(jìn)行活體檢測，在外植體再生階段時只能對再生芽進(jìn)行破壞性的檢測。相比之下，利用GFP熒光觀察可以活體鑒定轉(zhuǎn)基因材料，且操作簡單觀測結(jié)果準(zhǔn)確，能有效減少假陽性的問題。Priyadarshani等[27]利用GFP報告基因?qū)Σぬ}進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化使轉(zhuǎn)基因菠蘿的篩選變得簡單、無損；Jung等[28]利用GFP監(jiān)測技術(shù)檢測辣椒早期發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因，提高辣椒遺傳轉(zhuǎn)化效率；Hu等[19]利用GFP報告基因在外植體發(fā)育早期對黃瓜轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，在共培養(yǎng)3 d之后就能檢測到微弱的熒光信號。因此，利用GFP作為報告基因在外植體發(fā)育早期就可以進(jìn)行篩選鑒定，更為簡便快捷。本研究以GFP作為報告基因，在轉(zhuǎn)化外植體分化2周后進(jìn)行熒光觀察鑒定陽性轉(zhuǎn)化事件，避免了大量再生芽的馴化、DNA提取及PCR檢測等工作，并利用GFP報告基因?qū)Τ墒斓年栃灾仓旮鹘M織部位進(jìn)行觀察鑒定，極大提高了轉(zhuǎn)基因植株的篩選效率。

共培養(yǎng)階段是農(nóng)桿菌對植物細(xì)胞完成侵染的關(guān)鍵時期，共培養(yǎng)溫度對T-DNA的轉(zhuǎn)移有著明顯影響。農(nóng)桿菌的最適生長溫度為28℃，但農(nóng)桿菌的最適生長溫度不一定是農(nóng)桿菌具備最強(qiáng)侵染效力的溫度。Fullner等[29]研究認(rèn)為，T-DNA轉(zhuǎn)移的最適溫度為19℃，最利于T-DNA復(fù)合物的組裝和轉(zhuǎn)移。此外，vir基因的誘導(dǎo)和外源DNA片段的整合及穩(wěn)定表達(dá)應(yīng)在25℃，溫度高于32℃就有可能影響其活性[30]。本研究通過設(shè)置不同的共培養(yǎng)溫度進(jìn)行黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)共培養(yǎng)溫度處于23℃時，外植體的分化率和陽性誘導(dǎo)率都優(yōu)于其他組。

利用T-DNA插入創(chuàng)制突變體的一個顯著優(yōu)點就是能夠快速得到插入位點的T-DNA側(cè)翼序列[31]，為突變基因的定位節(jié)省了大量時間。側(cè)翼序列的擴(kuò)增包括TAIL-PCR、質(zhì)粒拯救、PCR步移以及反向PCR等多種方法，其中TAIL-PCR操作簡便、特異性高、靈敏度高，PCR產(chǎn)物可以直接用于測序，被廣泛應(yīng)用于各類插入突變體庫側(cè)翼序列的分離[32]。本研究利用TAIL-PCR成功分離得到黃瓜T-DNA插入突變體的T-DNA側(cè)翼序列，通過對黃瓜基因組進(jìn)行序列比對，確定T-DNA片段插入到CsaV3_1G032940基因(BHP)的外顯子中，該基因在擬南芥中的同源基因為AT4G18950，與植物介導(dǎo)藍(lán)光依賴性氣孔開放有關(guān)[33]，但目前在正常栽培條件下，該基因的T-DNA插入突變體與野生型表型無明顯差異，在今后的研究中會對該基因在突變體中的表達(dá)以及該突變體在藍(lán)光條件處理下的表型鑒定進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究確定了農(nóng)桿菌C58的菌液最佳取樣時期為搖菌后12～18 h，農(nóng)桿菌侵染的最佳共培養(yǎng)溫度為23℃，并利用GFP報告基因顯著提升了轉(zhuǎn)化植株的篩選效率，同時通過TAIL-PCR成功克隆得到突變體的T-DNA側(cè)翼序列，進(jìn)一步確定了突變體的插入位點，此方法能有效應(yīng)用于黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化中，并為黃瓜及葫蘆科其他作物的相關(guān)研究提供了參考。但侵染效率過低仍是限制轉(zhuǎn)化效率的最主要原因，后續(xù)研究將進(jìn)一步從黃瓜基因型篩選、轉(zhuǎn)化載體的選擇、共培養(yǎng)處理方式等方面開展轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化，同時開展黃瓜花粉管通道法、花粉磁轉(zhuǎn)染等轉(zhuǎn)化技術(shù)的探索。