高粱轉(zhuǎn)錄因子SbWRKY71基因的克隆及其在逆境脅迫下的表達(dá)分析

杜巧麗 蔣君梅 陳美晴 方遠(yuǎn)鵬 李向陽 任明見,2 謝 鑫,*

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2 國家小麥改良中心貴州分中心，貴州 貴陽 550025；3 貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

高粱(Sorghumbicolor)屬于禾本科單子葉植物，是一種典型的旱糧經(jīng)濟(jì)作物，具較強(qiáng)的耐鹽堿性、抗旱性、耐高溫等抗逆特性[1]。但近年來，高粱受到病毒[2]、重金屬[3]和真菌[4]等逆境脅迫，以及多種非生物逆境脅迫的影響，如低溫[5]、干旱、高鹽[6]等，嚴(yán)重影響高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，對(duì)高粱抗逆境脅迫基因進(jìn)行研究具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)又稱反式作用因子，在植物次生代謝過程具有重要作用。它也可特異性與基因的啟動(dòng)子結(jié)合，在基因的表達(dá)過程中起調(diào)控作用，同時(shí)還能結(jié)合生物體內(nèi)外的信號(hào)因子，進(jìn)而對(duì)外界環(huán)境刺激做出應(yīng)答反應(yīng)[7-8]。植物轉(zhuǎn)錄因子主要分為2種，一種為特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們主要通過選擇性調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，另一種是非特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過非選擇性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)(如開花[10]、衰老[11]、生長繁殖[12]、非生物脅迫[13]和生物脅迫[14])。WRKY作為植物中一類重要轉(zhuǎn)錄因子，在植物的整個(gè)生長周期中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的核心氨基酸序列，在C-末端含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可對(duì)(T)(T)TGAC(C/T)序列進(jìn)行特異性識(shí)別，同時(shí)參與植物的抗病反應(yīng)[15-16]；WRKY71作為WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，目前已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[17]、水稻(Oryzasativa)[18]、草莓(Fragariavesca)[19]、芥菜(Brassicajuncea)[20]、玉米(Zeamays)[21]等植物中報(bào)道，但鮮見WRKY71基因在高粱中的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)從高粱中克隆得到一個(gè)SbWRKY71基因，利用生物信息學(xué)方法研究其基本特征，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)檢測(cè)SbWRKY71基因在不同組織、不同激素以及逆境脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量，了解其在抗逆脅迫中的作用，旨在為SbWRKY71基因的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 高粱品種及處理方法 本研究所用高粱BTx623品種由貴州大學(xué)植物病理教研室保存。高粱種子處理方法及培養(yǎng)條件參照蔣君梅等[22]的方法，使用激素脫落酸(abscisic acid，ABA，200 μmol·L-1)、水楊酸(salicylic acid，SA，1 mmol·L-1)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA，10 μmol·L-1)、氯化鈉(NaCl，250 mmol·L-1)、γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid，GABA，1 mmol·L-1)、 甘露醇(D-Mannitol，300 mmol·L-1)、鞭毛蛋白(flg22，100 nmol·L-1)、翻譯延長因子(translation elongation factor，elf18，100 nmol·L-1)和幾丁質(zhì)(Chitin，8 nmol·L-1)進(jìn)行噴施處理，分別在0、0.5、1、3、6、9、12和24 h進(jìn)行取樣，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理3株苗，將所取樣品立即用液氮進(jìn)行速凍，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 本研究采用北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司的RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒；ABA、SA、IAA、NaCl、GABA、D-Mannitol試劑均購自北京酷來搏科技有限公司；flg22、elf18和Chitin分別購自南京金斯瑞生物科技有限公司、美國Ezbiolab和圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 高粱SbWRKY71基因克隆

取處理好的高粱樣品，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用引物SbWRKY71-F/SbWRKY71-R對(duì)SbWRKY71基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入pEASY-Blunt載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系參照陳美晴等[23]的方法。

1.3 生物信息學(xué)分析

獲取其他物種SbWRKY71同源蛋白序列，利用MEGA7.0軟件，以鄰接法(neighbor-joining，NJ；bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，后經(jīng)DNAMAN6.0完成序列比對(duì)；根據(jù)EXPASy[24](https://web.expasy.org/)完成SbWRKY71蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；SbWRKY71蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定、亞細(xì)胞定位等生物信息學(xué)分析參照已報(bào)道的方法[25]。

1.4 高粱SbWRKY71基因表達(dá)分析

以高粱SbEIF4a為內(nèi)參基因，分別以高粱不同組織以及經(jīng)不同條件處理后的葉片總cDNA為模板，檢測(cè)SbWRKY71基因表達(dá)量。擴(kuò)增引物如表1所示，擴(kuò)增體系參照已報(bào)道的方法[24]。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱SbWRKY71基因的PCR擴(kuò)增

以高粱BTx623苗期cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到序列大小為1 335 bp的目的基因片段，共編碼364個(gè)氨基酸。隨后采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)(圖1)，并進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，得到的條帶大小與數(shù)據(jù)庫中的一致。

Note：1：SbWRKY71. M：Marker.

2.2 高粱SbWRKY71蛋白理化性質(zhì)分析及序列分析

采用Prot-param工具對(duì)SbWRKY71蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析(表2)；同時(shí)利用Softberry軟件對(duì)SbWRKY71蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核。

表2 SbWRKY71基因編碼蛋白的基本特征

利用DNAMAN6.0將高粱SbWRKY71與其他物種的WRKY71氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)及同源性分析，如圖2所示，不同物種間WRKY71相關(guān)蛋白的氨基酸序列均存在1個(gè)保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，整體一致性為63%，即WRKY71在不同植物間相對(duì)保守。同時(shí)利用MEGA7.0對(duì)水稻、短柄草、玉米、高粱、小麥和二穗短柄草等物種的WRKY71蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果表明，高粱SbWRKY71與禾本科作物玉米ZmWRKY71的親緣關(guān)系最近，且為75%(圖3)。

注：黑色框表示W(wǎng)RKY71蛋白保守結(jié)構(gòu)域；Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麥(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)。

注：Sb：高粱(Sorghum bicolor)；Zm：玉米(Zea mays)；Si：谷子(Setaria italica)；Os：水稻(Oryza sativa)；Ta：小麥(Triticum aestivum)；Bd：二穗短柄草(Brachypo diumdistachyon)；Eg：油棕(Elaeis guineensis)；Gh：棉花(Gossypium hirsutum)；Br：油菜(Brassica rapa)；At：擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Va：葡萄(Vitis amurensis)；Cp：臘梅(Chimonanthus praecox)；Pc：櫻桃(Prunus cerasus)。

2.3 高粱 SbWRKY71蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用NPS@在線預(yù)測(cè)SbWRKY71蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，SbWRKY71蛋白由364個(gè)氨基酸組成，其中α-螺旋占32.69%，無規(guī)則卷曲占61.54%，無β-折疊。利用SMART在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白保守功能域，SbWRKY71蛋白主要含有2個(gè)低復(fù)雜區(qū)和1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域。通過SWISS-MODEL預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)SbWRKY71蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖4)，與NPS@預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

圖4 SbWRKY71蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 高粱SbWRKY71基因順勢(shì)作用元件分析

利用PlantCARE對(duì)SbWRKY71基因的順勢(shì)作用元件進(jìn)行分析(表3)，結(jié)果表明SbWRKY71基因可能參與脫落酸、茉莉酸等信號(hào)通路。

表3 SbWRKY71基因啟動(dòng)子區(qū)順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)

2.5 SbWRKY71基因表達(dá)分析

2.5.1SbWRKY71基因組織表達(dá)特征 為探究SbWRKY71基因的組織表達(dá)模式，采用qRT-PCR分析SbWRKY71在高粱根、莖、葉和芽中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，SbWRKY71基因在根、莖、葉和芽不同組織均有表達(dá)，并具有組織特異性，其中在葉中的表達(dá)最高，其次是根，在莖和芽中表達(dá)較少(圖5)。

注：不同小寫字母表示相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異(P<0.05)；內(nèi)參基因：SbEIF4a。下同。

2.5.2SbWRKY71基因響應(yīng)激素表達(dá)分析 為檢測(cè)植物激素是否影響SbWRKY71的表達(dá)，分別用SA、ABA和IAA處理高粱，發(fā)現(xiàn)在SA處理下，SbWRKY71的表達(dá)呈先升后降趨勢(shì)(圖6-A)，ABA和IAA處理后，SbWRKY71的表達(dá)呈現(xiàn)先下降后升高再下降的趨勢(shì)(圖6-A、B、C)，基因表達(dá)量均在6 h出現(xiàn)最大值。

2.5.3SbWRKY71基因響應(yīng)干旱及鹽脅迫表達(dá)分析 用GABA、D-Mannitol、NaCl模擬干旱及鹽脅迫，對(duì)SbWRKY71基因表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在GABA(圖6-D)、D-Mannitol(圖6-E)和NaCl(圖6-F)處理下，SbWRKY71基因均受到誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)量分別在3、6和9 h達(dá)到最大值。以上結(jié)果說明SbWRKY71可能是高粱響應(yīng)干旱及鹽脅迫的一個(gè)功能基因。

2.5.4SbWRKY71基因響應(yīng)病原相關(guān)分子模式(PAMPs)表達(dá)分析 為檢測(cè)SbWRKY71在PAMPs激發(fā)子flg22、elf18和Chitin處理下的表達(dá)量變化，分別用flg22、elf18和Chitin模擬高粱生物脅迫下的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)flg22、elf18處理后，SbWRKY71基因表達(dá)量在極短時(shí)間內(nèi)均被顯著抑制，之后表達(dá)量幾乎維持在相同水平(圖6-G、I)，但在Chitin處理下，SbWRKY71基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先升后降的表達(dá)模式(圖6-H)。上述結(jié)果表明，SbWRKY71基因表達(dá)受到flg22和elf18的顯著抑制，而受到Chitin的誘導(dǎo)表達(dá)，綜上所述，SbWRKY71在參與植物先天免疫應(yīng)答過程中具有重要作用。

圖6 SbWRKY71基因表達(dá)分析

3 討論

植物在生長過程中可能會(huì)遭受各種非生物和生物脅迫，此時(shí)植物自身會(huì)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的防御機(jī)制(包括生理和代謝過程中的防御反應(yīng))，來保護(hù)自身免受各種逆境脅迫的危害。這些防御反應(yīng)過程涉及復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并通過大量的轉(zhuǎn)錄因子和防御反應(yīng)基因?qū)Ψ烙^程進(jìn)行調(diào)節(jié)。植物中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物的生長發(fā)育、防御反應(yīng)和代謝調(diào)控[26]。大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在受到病原菌[如丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、黃單胞菌(Xanthomonasaxonopodis)]侵染后，可能被作為正調(diào)控因子，也可能被作為負(fù)調(diào)控因子[27-28]。在小麥[29]、擬南芥[30-31]和水稻[18]中，WRKY71基因分別在調(diào)控植物應(yīng)對(duì)病害抗性、葉發(fā)育、花期調(diào)控以及非生物脅迫等中具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過激素SA處理后的高粱SbWRKY71基因表達(dá)量在較短時(shí)間內(nèi)顯著上調(diào)，處理6 h時(shí)表達(dá)量升高并達(dá)到最大值，在12 h又顯著降低，這與在玉米中[21]的研究存在一定相似性，即ZmWRKY71的表達(dá)基本呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的情況，說明在不同物種中WRKY71基因在激素應(yīng)答過程中存在一定差異；在ABA處理下，SbWRKY71的基因表達(dá)量在1 h被顯著抑制，但在6 h又被顯著誘導(dǎo)并達(dá)到最大值，而在擬南芥中[17,31]，AtWRKY71在ABA處理下，基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，從側(cè)面暗示W(wǎng)RKY71基因在參與調(diào)控植物應(yīng)對(duì)激素應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用。此外，該類基因在組織表達(dá)上也存在顯著差異，SbWRKY71基因主要表現(xiàn)在葉中表達(dá)，在莖中低表達(dá)，但在草莓中[19]，F(xiàn)vWRKY71基因主要在果實(shí)中表達(dá)，并且該基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟表達(dá)量顯著升高，而OsWRKY71在孕穗期劍葉中表達(dá)量最高[18]，由此可知WRKY71基因的特異表達(dá)在不同物種中也存在一定的差異性；在NaCl處理下，SbWRKY71基因表達(dá)呈先升后降趨勢(shì)，即在9 h達(dá)到最大值，大約持續(xù)3 h后，又顯著下調(diào)；這與芥菜型油菜[20](Brassicajuncea)部分基因在高鹽處理下的研究結(jié)果一致，即BjuWRKY71-1、BjuWRKY71-2和BjuWRKY71-4基因的表達(dá)量呈先升后降模式，但BjuWRKY71-3基因在高鹽條件下，其表達(dá)量在24 h內(nèi)一直逐漸升高，同時(shí)與擬南芥AtWRKY40同源的基因BnD11在抗旱性品種中報(bào)道極為相似[32]；在小麥中[33]，TaWRKY33也能受到NaCl的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥和小麥對(duì)鹽的耐受性，由此說明不同WRKY轉(zhuǎn)錄因子在感知鹽脅迫下的基因表達(dá)存在相同的現(xiàn)象。在模擬干旱脅迫下，SbWRKY71基因在6 h時(shí)受到顯著誘導(dǎo)，其他時(shí)間點(diǎn)維持在相同水平，在擬南芥中，WRKY71的過表達(dá)能誘導(dǎo)擬南芥種子萌發(fā)，并對(duì)干旱脅迫顯得更加敏感，說明WRKY71基因可能是響應(yīng)干旱脅迫的一個(gè)功能基因。在flg22、elf18模擬生物脅迫下，SbWRKY71基因的表達(dá)量在較短時(shí)間內(nèi)被顯著抑制，這與桑樹(Morusalba)中MaWRKY29的研究結(jié)果一致[34]，說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在參與植物先天免疫應(yīng)答過程中具有重要作用。

有研究指出，水稻W(wǎng)RKY71轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY71基因在耐冷過程中主要起正調(diào)控作用[35]；同時(shí)在擬南芥中，過表達(dá)AtWRKY71基因有助于增強(qiáng)植物對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的敏感性[36]；推測(cè)SbWRKY71基因在病原侵染及冷脅迫應(yīng)答過程中也可能有類似的功能，因此本研究有望為今后進(jìn)一步研究SbWRKY71基因的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從高粱中克隆的SbWRKY71基因是一個(gè)帶有典型WRKY結(jié)構(gòu)域的WRKY家族成員，根據(jù)多序列比對(duì)，高粱SbWRKY71與玉米親緣關(guān)系最近，編碼364個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為38.95 kDa，其理論等電點(diǎn)為8.5(堿性蛋白)。RT-qPCR結(jié)果表明，SbWRKY71基因表達(dá)具有組織特異性，且受植物激素、干旱、鹽脅迫以及PAMPs的影響。本研究為進(jìn)一步揭示W(wǎng)RKY71基因的生物學(xué)功能，以及在調(diào)節(jié)高粱抗性和響應(yīng)植物激素等過程中的作用提供了基礎(chǔ)。