蘇卡達陸龜尿酸的固體成分和尿結(jié)石的性狀及顯微結(jié)構(gòu)觀察

丁荔佳,成 奇,潘連德,3 *,徐金鋮,劉宇婷

(1.上海海洋大學(xué) 上海省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2.上海綺異動物?？漆t(yī)院，上海 200335；3.上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫，上海 201306)

尿酸是蘇卡達陸龜(Centrochelyssulcata)等爬行動物排泄含氮廢物的主要成分，與陸龜尿結(jié)石的形成有著密切關(guān)系[1]，陸龜血液的尿酸指標(biāo)能夠評估陸龜?shù)臓I養(yǎng)狀況[2]，陸龜性別、種類、季節(jié)也影響尿酸的形成和排泄[3]。蘇卡達陸龜、印度星龜(Geocheloneelegans)等幾種易產(chǎn)生結(jié)石的沙漠型陸龜在正常代謝時存在排泄尿酸的行為[4]，其較大的膀胱有著儲存尿液、濃縮尿液、循環(huán)利用水分的能力，與水龜、半水龜相比，沙漠型陸龜有著更大的膀胱，對尿液中水分重吸收的能力更強[5]。儲存于野生和人工養(yǎng)殖陸龜膀胱中的尿酸會形成尿酸鹽固體成分[1]，陸龜代謝正常時，尿酸鹽固體成分會隨著尿液排出體外，當(dāng)陸龜代謝異常時，尿酸鹽固體成分在尿結(jié)石核子如細菌、壞死細胞和組織等尿道異物的影響下會在膀胱內(nèi)形成尿結(jié)石。微小的尿結(jié)石隨著尿液排出體外，則不會影響陸龜?shù)纳L，否則，尿結(jié)石在膀胱中越長越大，就會患尿結(jié)石癥。陸龜患尿結(jié)石癥后，常表現(xiàn)出厭食、精神萎靡不振、不愿爬動、常做排便姿勢但尿液和糞便排泄困難、后肢或泄殖腔腫脹等臨床癥狀[2,6-7]。當(dāng)較大的尿結(jié)石位于泄殖腔并堵塞尿道口或肛門口時，會導(dǎo)致糞便堵塞性腸梗阻，造成陸龜死亡[1-2,5,7-8]。尿石癥最常見于生活在原始干旱氣候環(huán)境中的陸龜，如蘇卡達陸龜[1-2,7]、沙漠地鼠龜(Gopherusagassizii)[6,9]常發(fā)此癥。通過X射線和 CT影像學(xué)技術(shù)檢驗，可查明尿結(jié)石在陸龜體腔中的位置、大小及其數(shù)量[2]。臨床實踐中，通過中指自泄殖孔插進泄殖腔并觸摸內(nèi)容物，或雙手指通過后肢股前窩觸摸體腔，也可初步檢查尿結(jié)石及其大小。陸龜患尿結(jié)石癥后通常需要外科手術(shù)，根據(jù)病龜大小、尿結(jié)石在病龜體腔中的位置和大小，可選用泄殖腔碎石手術(shù)[7]、腹部開甲手術(shù)[1,5,8,10]、跨窩軟組織切開術(shù)[2,7]等方法去除尿結(jié)石。尿結(jié)石取出來后，可通過定性定量多種分析方法測定其成分[11]以揭示尿結(jié)石的屬性。為深入了解蘇卡達陸龜尿酸和尿結(jié)石的性狀和結(jié)構(gòu)開展本研究，以期為陸龜人工養(yǎng)殖和尿石癥的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及其尿酸和尿結(jié)石樣品的采集、處理和保存尿酸樣品采自海南省?？阢r(nóng)業(yè)養(yǎng)殖公司的 20只人工養(yǎng)殖蘇卡達陸龜(圖1A)，體寬 45 cm 左右，體長 54 cm左右，體質(zhì)量約30 kg，成年種龜編號 1～20號(圖1A)。蘇卡達陸龜及其尿結(jié)石來自上海綺異動物?？漆t(yī)院，編號為 21 號(圖2A)和 22 號，均為雌性，體質(zhì)量為 2.8 kg，病龜均厭食多日，精神萎靡不振，泄殖腔腫脹，多日未排除尿酸和糞便。在晴天上午 8:00-10:00 和下午 2:00-4:00 采集2次樣品，用吸管吸取剛排出未被污染的尿酸，手術(shù)刀刮去表面污染區(qū)域后，湯勺挖取牙膏狀尿酸；對于自然條件下風(fēng)干的尿酸樣品，采集時挑選形態(tài)較為完整，未被污染的部分，再用自來水清洗過濾除去雜質(zhì)后暫存于 50 mL的離心管中。對采集后的樣品預(yù)處理和臨床觀察，挑選出20 份，依次編號1～20 號，常溫保存。樣品帶回實驗室后，經(jīng) 80℃立式鼓風(fēng)干燥箱(HTG-9240A)內(nèi)干燥 24 h，從中選出3類(圖1B,C,D)6 個尿酸樣品(3，4，5，6，7，15 號)，對樣品進行觀察、采集照片和匯總特征。21號和22號蘇卡達陸龜患尿結(jié)石癥后，通過 X光照片確定尿結(jié)石在病龜體內(nèi)的位置、大小(圖2B)，然后在無菌環(huán)境中進行腹部開甲手術(shù)取石(圖2C)。術(shù)后取出的尿結(jié)石用自來水沖洗，去除污物及血漬，稱測質(zhì)量，分割，取其體積的 1/8，用手術(shù)刀和鑷子將21號樣品按照“樹輪”由外到內(nèi)分層剝離成10層暫放于培養(yǎng)皿中，核心層記為 Core，核心層由內(nèi)到外按層依次記為L1～L10(圖3)。

A.3 號蘇卡達陸龜一邊進食一邊排尿酸(↑);B.蘇卡達陸龜液體或膠狀尿酸(↑)；C.蘇卡達陸龜半固體或牙膏狀尿酸(↑)；D.蘇卡達陸龜自然風(fēng)干后的尿酸固體(←)

A.患尿結(jié)石癥的 21號蘇卡達陸龜;B.X光照片顯示出尿結(jié)石(←)；C.膀胱中尿結(jié)石(←)；D.取石手術(shù)后的狀態(tài)

Core.核心層為空；L1.第1層；L2.第2層；L3.第3層；L4.第4層；L5.第5層；L6.第6層；L7.第7層；L8.第8層；L9.第9層；L10.第10層，即最外一層。放大倍數(shù).4.16倍

1.2 蘇卡達陸龜尿酸的固體成分和尿結(jié)石掃描電鏡樣品處理及觀察尿酸的固體成分和 21號尿結(jié)石分層樣品及 22號尿結(jié)石隨機樣品處理為 0.3 cm3的小塊，置于掃描電鏡樣品盤上的導(dǎo)電膠固定(圖4A,C)；將樣品放入離子濺射裝置(E-1010，日立)內(nèi)抽真空，電壓控制在 4 V 以下，16 min 后進入噴金模式(圖4B,D)，50 s 后將樣品取出置于掃描電子顯微鏡(S3400，日立)載物臺中，調(diào)試參數(shù)，觀察并采集圖片。

A.固定于掃描電鏡樣品盤導(dǎo)電膠上的 6 個尿酸固體成分和 2 個尿結(jié)石樣品；B.噴金后的 8 個樣品；C.固定于掃描電鏡樣品盤導(dǎo)電膠上的 21 號尿結(jié)石分層樣品；D.噴金后的 21 號分層樣品

2 結(jié)果

2.1 蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分性狀和結(jié)構(gòu)

2.1.1尿酸及其固體成分眼觀性狀和結(jié)構(gòu) 蘇卡達陸龜排出的尿酸有白色、乳白色、黃色等顏色，其形態(tài)各異，有的稀薄、有的黏稠呈半固體狀。尿酸放置在樣品管中會形成半固體或固體(圖5A,C)，在自然狀態(tài)下風(fēng)干會形成固體(圖5E)，高溫干燥后全部形成固體(圖5B,D,F)，其質(zhì)地松脆，顏色略有改變(表1)。

A.干燥前的 15 號樣品,部分表面呈黃色(↑)；B.干燥后的 15 號樣品，部分邊緣呈微黃色(↑);C.干燥前的 3 號樣品，部分邊緣呈卷曲狀(←)；D.干燥后的 3 號樣品；E.干燥前的 5 號樣品，部分剖面呈淡黃色(←)；F.干燥后的 5 號樣品，部分剖面呈淡黃色(←)

表1 6個蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分樣品的形態(tài)變化

2.1.2蘇卡達陸龜尿酸固體成分的掃描電鏡結(jié)構(gòu)特征 在掃描電鏡 24倍鏡下，6個尿酸樣品的固體成分均為表面粗糙石塊狀(圖6A)。在 100倍和 500倍鏡下，3號樣品為片狀和顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6B)，4號樣品為片狀和石礫狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6C)，5號樣品為片狀和顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6B)，6號樣品為顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6D)，7號樣品為火山巖狀結(jié)構(gòu)(圖6E)，15號樣品為顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6D)。在 1 000～4 000倍鏡下，3號樣品為煤渣狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6F)，4號樣品為碎石狀結(jié)構(gòu)(圖6G)，5號樣品為片狀(圖6H)和煤渣狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6F)，6號樣品為海綿狀結(jié)構(gòu)(圖6I)，7號樣品為海綿狀結(jié)構(gòu)(圖6I),15號樣品為煤渣狀結(jié)構(gòu)混合物(圖6F)。

A.3號樣品，24×，表面粗糙石塊狀；B.3 號樣品，500×，片狀和顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物;C.4 號樣品,500×,片狀和石礫狀結(jié)構(gòu)混合物；D.6 號樣品,100×，顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物;E.7 號樣品，500×，火山巖狀；F.3 號樣品，2 000×，煤渣狀結(jié)構(gòu)；G.4 號樣品，2 000×，碎石狀結(jié)構(gòu);H.5號樣品，2 000×,片狀結(jié)構(gòu);I.6 號樣品，3 000×，海綿狀結(jié)構(gòu)

2.2 蘇卡達陸龜尿結(jié)石性狀和結(jié)構(gòu)

2.2.1蘇卡達陸龜尿結(jié)石眼觀性狀及結(jié)構(gòu) 21號蘇卡達陸龜尿結(jié)石剛?cè)〕鰰r，形態(tài)呈圓球狀，比乒乓球稍大，直徑 50 mm，質(zhì)量 40 g(圖 7A)；22 號樣品呈橢圓形狀，長徑 58 mm，短徑 53 mm，質(zhì)量 45 g。尿結(jié)石表面粗糙，如同月球表面，質(zhì)地硬。21號尿結(jié)石取出后用鋼鋸對其按總體積的1/2切割(圖7B)、1/4切割、1/8切割(圖7C)切開，用自來水沖洗后的剖面呈樹輪狀分層，表面有大量分布不均的空隙，每層尿結(jié)石面積不均，形態(tài)各異，由灰色、白色、乳白色、少量淺紅色、淡黃色等顏色組成，核心層(Core)為空，由內(nèi)到外按層依次記為 L1～L10，在解剖顯微鏡(OLYMPUS，SZ61)4.16 倍觀察分層結(jié)構(gòu)(圖3)。

A.手術(shù)取出的尿結(jié)石和乒乓球合照；B.1/2切割清洗過的尿結(jié)石(中間)；C.1/8切割清洗過的尿結(jié)石

2.2.2蘇卡達陸龜尿結(jié)石的掃描電鏡結(jié)構(gòu)特征 在掃描電鏡 24倍鏡下, 21號蘇卡達陸龜尿結(jié)石分層樣品 L1～L10及 22號尿結(jié)石隨機樣品均為表面粗糙石塊狀(圖 8A)。在 100倍和 500倍鏡下，L1層為泥沙和顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物(圖 8B)，L2層為泥沙和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)混合物(圖 8C)，L3-L7層為泥沙和煤渣狀混合物(圖8 D)和珊瑚石狀結(jié)構(gòu)(圖8 F)，L4層為泥沙狀混合物(圖 8E)，L5層為珊瑚石狀結(jié)構(gòu)(圖 8F)，L6層為泥巴和泥沙混合物(圖 8G)，L8層為泥巴和泥沙混合物(圖8G)及泥沙狀混合結(jié)構(gòu)(圖8E)。500倍鏡下，22號樣品隨機層為煤渣狀結(jié)構(gòu)(圖8H)。在1 000～4 000倍鏡下，L5層為海綿狀結(jié)構(gòu)(圖 8I),L9層為紫菜狀結(jié)構(gòu)(圖 8J)，L10層為煤渣狀和纖維狀混合結(jié)構(gòu)(圖8K),L3 層為海綿狀結(jié)構(gòu)(圖8L)。

A.21號樣品，L2層，24倍，表面粗糙石塊狀；B.21號樣品，L1層，500×,泥沙和顆粒狀結(jié)構(gòu)混合物；C.21號樣品，L2層，500×,泥沙和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)混合物；D.21號樣品，L3層，100×,泥沙和煤渣狀混合物；E.21號樣品，L4層，×100,泥沙狀混合物；F.21號樣品，L5層，500×,珊瑚石狀結(jié)構(gòu)；G.21號樣品，L6層，100×,泥巴和泥沙混合物；H.22號樣品，隨機層，500×,煤渣狀結(jié)構(gòu)；I.21號樣品，L5層，4 000×,海綿狀結(jié)構(gòu);J.21號樣品，L9層，1 000×,紫菜狀結(jié)構(gòu);K.21號樣品，L10層，2 000×,煤渣狀和纖維狀混合結(jié)構(gòu);L.21號樣品，L3層，1 000×海綿狀結(jié)構(gòu)

3 討論

3.1 蘇卡達陸龜尿酸及其固體成分和尿結(jié)石的特征陸龜尿液中會積累大量的尿酸，和尿液一樣尿酸也是陸龜[9]、蜥蜴、蛇、鱷魚[12]等爬行動物排氮的主要形式，其尿酸在尿液中積累、轉(zhuǎn)化后會形成尿酸鹽或固體顆粒，受尿液pH的影響，尿酸以液體狀尿酸或半固體尿酸鹽的形式排出體外[13]。由于尿酸成分及其濃度的變化，新鮮尿酸排泄物會有豆?jié){狀、膠狀、牙膏狀、石礫狀等各種各樣的形態(tài)，尿酸排出后，經(jīng)自然風(fēng)干或高溫干燥后會變成表面粗糙的石塊狀。在掃描電鏡下，尿酸固體成分有表面粗糙石塊狀、片狀、顆粒狀、石礫狀、細沙狀、火山巖狀、泥巴狀、煤渣狀和海綿狀等多樣化結(jié)構(gòu)特征，與犬的4種尿結(jié)石的性狀和掃描電鏡結(jié)構(gòu)不同[14]。蘇卡達陸龜膀胱中的尿結(jié)石呈球體或橢圓形狀[1,2,5]，表面粗糙，質(zhì)地松散，有大量分布不均的空隙，剖面像樹輪一樣逐層增長；每層尿石面積不均，形態(tài)各異[2]，由乳白色、黃色、棕色等多種顏色組成，與軍曹魚(Rachycentroncanadum)[15]膀胱中的尿結(jié)石形態(tài)相似。

3.2 蘇卡達陸龜尿酸的固體成分及其尿結(jié)石的關(guān)聯(lián)蘇卡達陸龜將尿酸和尿液儲存在膀胱中，缺水時，若其膀胱內(nèi)的尿酸和尿酸鹽不能及時排出體外就會在體內(nèi)積聚形成尿結(jié)石[7]。蘇卡達陸龜尿酸固體成分為質(zhì)地松脆易碎的不規(guī)則固體、顆粒狀固體、團狀固體及塊狀固體，其中粉砂狀和顆粒狀的形態(tài)與波爾山羊和水牛膀胱結(jié)石形態(tài)類似，與質(zhì)地堅硬、外觀呈球形或橢圓形、內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈樹輪狀分層[2]的蘇卡達陸龜尿結(jié)石形態(tài)存在差異。在掃描電鏡下，蘇卡達陸龜尿酸樣品固體成分結(jié)構(gòu)與尿結(jié)石各層掃描電鏡結(jié)構(gòu)有部分相似之處，但蘇卡達陸龜尿結(jié)石無片狀、石礫狀、細沙狀、火山巖狀等結(jié)構(gòu)，其主要原因是蘇卡達陸龜尿結(jié)石在膀胱內(nèi)的形成是由無數(shù)尿酸鹽和尿結(jié)石形成因子共同組成，而尿酸鹽是尿酸的主要固體成分[16-19]。波爾山羊尿結(jié)石由少量柱狀晶體和多種形態(tài)的顆?；旌衔锝M成[20]，水牛尿結(jié)石由細小顆粒和斜方柱狀晶體混合組成[20-21]，與蘇卡達陸龜尿結(jié)石掃描電鏡結(jié)構(gòu)不同。

3.3 蘇卡達陸龜尿酸的健康管理和預(yù)防尿結(jié)石的臨床建議蘇卡達陸龜對于養(yǎng)殖環(huán)境中的溫度、濕度、光照和食物有獨特的要求，它們依靠環(huán)境的熱量和自身行為來調(diào)節(jié)適宜體溫。在日常管理中，建議環(huán)境溫度保持在 26～30℃，濕度保持在 40%～80%，食物以高纖維、高鈣、低磷、低蛋白、低水分的水果蔬菜為主。為促進陸龜對鈣質(zhì)的吸收，飼養(yǎng)場應(yīng)配備全光譜太陽燈，天氣好時帶龜曬太陽，做運動，在龜場水池泡澡，以促進陸龜排出尿酸，避免形成尿結(jié)石。日常管理應(yīng)注意觀察蘇卡達陸龜排除尿酸的數(shù)量和性狀，若發(fā)現(xiàn)有尿酸排泄減少、有尿結(jié)石顆粒排出或狀態(tài)不好的情況，應(yīng)對其仔細檢查，及時排除病因，以防止尿石癥發(fā)生，蘇卡達陸龜一旦確診為尿石癥，應(yīng)及時就醫(yī)[2,5]。