多殺性巴氏桿菌主要毒力因子研究進(jìn)展

尹媛媛，何 芳，趙光夫，李 攀，李能章，彭遠(yuǎn)義*

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 400715；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一種革蘭陰性短桿菌，分別根據(jù)其莢膜抗原或脂多糖的多樣性，可分為A、B、D、E、F共5種血清群或1～16共16個(gè)血清型。臨床上，該病原主要導(dǎo)致動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病、局灶性感染及出血性敗血癥，如牛肺炎、禽霍亂、有蹄動(dòng)物的出血性敗血癥、豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎、兔鼻瘺、牛羊豬等的船運(yùn)熱，以及人的皮膚膿腫、腦膜炎、蜂窩織炎、腹膜炎等[1]。Pm屬于條件性致病菌，正常情況下常存于動(dòng)物口腔、消化道和呼吸道，極少致病。當(dāng)天氣驟變、飼養(yǎng)環(huán)境差(如通風(fēng)不良、潮濕、擁擠、飼料霉變)、營養(yǎng)缺乏、疲勞等，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物免疫力降低，該菌易突破機(jī)體的防御屏障，經(jīng)淋巴液侵入黏膜并大量增殖，逃避宿主的固有免疫系統(tǒng)造成內(nèi)源性感染[2]。Pm引發(fā)的下呼吸道感染有極強(qiáng)的傳染性，可直接通過空氣傳播和直接接觸傳播。

近年來畜禽的頻繁調(diào)運(yùn)導(dǎo)致的運(yùn)輸應(yīng)激使Pm感染呈逐年上升趨勢(shì)，MOORE等[3]分析了2010—2012年自澳大利亞運(yùn)往中東、俄羅斯和中國的20次活牛長途運(yùn)輸中215頭牛死亡的病因，發(fā)現(xiàn)59.4%死于呼吸道疾病，其中72.0%發(fā)生包括Pm、溶血性曼氏桿菌和支原體在內(nèi)的病原微生物感染。Pm對(duì)人類健康同樣構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，人可被攜帶了Pm的貓、犬等寵物抓傷而感染[4]。GREEN等[5]對(duì)1989—1999年多殺性巴氏桿菌腦膜炎病例報(bào)告進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)17例患者中有5例(17%)患者出現(xiàn)了神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。SAMKAR等[6]統(tǒng)計(jì)了截止2016年多殺性巴氏桿菌腦膜炎成年患者(88例)的典型癥狀，發(fā)現(xiàn)100%患者伴隨發(fā)熱現(xiàn)象，88%出現(xiàn)頸部僵硬，63%出現(xiàn)頭疼，13%出現(xiàn)一定程度的后遺癥，最終有20%患者不幸去世。

Pm對(duì)宿主的感染是一個(gè)多步驟的過程，只有成功逃避宿主的免疫系統(tǒng)并獲得自身存活所需要的營養(yǎng)條件，才能在宿主體內(nèi)繁殖定居。毒力因子是Pm在宿主體內(nèi)存活、繁殖、致病的關(guān)鍵，對(duì)其致病性、在宿主體內(nèi)的存活和繁殖能力都有重要作用[7]。Pm具有多種毒力相關(guān)因子，主要包括LPS、莢膜、OMPs、三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、IROMPs、PlpE、PMT、PlpB、PtfA、FhaB和蛋白酶等[8]?，F(xiàn)就近10年來國內(nèi)外對(duì)Pm一些經(jīng)典的和新發(fā)現(xiàn)的毒力因子的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該菌的致病機(jī)制及新型疫苗研究提供參考。

1 脂多糖(LPS)

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜較厚的脂多糖類物質(zhì)，是細(xì)菌重要的毒力因子之一，參與細(xì)菌-宿主間相互作用(如識(shí)別、定殖和黏附中性粒細(xì)胞等)、膜屏障作用、發(fā)揮毒力作用和刺激宿主免疫反應(yīng)等。完整的LPS由高度保守的內(nèi)脂A(Lipid A)、疏水性的核心多糖和親水性的O-抗原共同構(gòu)成(圖1)，其中Lipid A包含脂肪酸鏈、磷酸基團(tuán)和內(nèi)核心寡糖，該結(jié)構(gòu)與致病性密切相關(guān)。Pm的LPS包括Lipid A和核心多糖，不含O-抗原，且其核心多糖由內(nèi)核心寡糖和外核心寡糖2部分組成。Pm有16種LPS血清型，其LPS合成基因分散于基因組中，不同血清型LPS的內(nèi)核組裝所需基因位于基因組的不同區(qū)域，而外核組裝所需基因的區(qū)域較為穩(wěn)定，成簇存在于保守基因priA和fpg之間的單個(gè)位點(diǎn)上，且不同血清型LPS可能具有相同的外核寡糖基因簇[9]。

圖1 LPS的完整結(jié)構(gòu)圖[10]

LPS的構(gòu)象與其致病力的強(qiáng)弱密切相關(guān)，研究表明，糖基轉(zhuǎn)移酶基因的突變、最外層磷酸膽堿殘基和內(nèi)核庚糖側(cè)鏈的缺失都會(huì)改變LPS的主要構(gòu)象，導(dǎo)致Lipid A暴露，從而增加Pm對(duì)抗菌肽的敏感性，降低其對(duì)天然免疫系統(tǒng)的抵抗力[11-12]。Pm的LPS和宿主糖蛋白結(jié)構(gòu)相似，故LPS在發(fā)揮致病性過程中可以模擬宿主分子，提高Pm在宿主生態(tài)位的生存能力[13]。

LPS可通過Toll樣受體4(TLR4)作用于免疫活性細(xì)胞，介導(dǎo)多種炎性因子的分泌[14]。胞外LPS與胞膜上TLR4相互作用后，激活MyD88-NF-κB信號(hào)通路，增強(qiáng)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11(Caspase-11)的前體物質(zhì)Pro-casp-11的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Pm通過自身形成含有高濃度LPS的外膜囊泡，經(jīng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)吞形成吞噬體后，進(jìn)入胞質(zhì)，再由鳥苷酸結(jié)合蛋白2(guanylate binding proteins 2，Gbp2)破壞囊泡，將LPS暴露在胞漿內(nèi)，與Pro-casp-11識(shí)別、聚合，并形成活化的Caspase-11。研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-11是導(dǎo)致內(nèi)毒素休克的關(guān)鍵因子?；罨腃aspase-11可通過剪切成孔蛋白GSDMD形成GSDMD-NT，多個(gè)GSDMD-NT在胞膜上聚合形成孔道，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡，產(chǎn)生典型的內(nèi)毒素性休克癥狀。同時(shí)活化的Caspase-11還能激活NLRP3/ASC-Caspase-1通路，介導(dǎo)IL-1β、IL-18等多種炎性因子的分泌與表達(dá)。當(dāng)Caspase-11過度活化，致使大量胞內(nèi)促炎介質(zhì)釋放到胞外，引起炎癥反應(yīng)(圖2)。盡管LPS可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，但研究表明Pm的LPS的交叉保護(hù)性極弱。同時(shí)，不同血清型Pm的LPS免疫不同動(dòng)物，產(chǎn)生的抗體水平和免疫保護(hù)效果也不同[15]。

圖2 LPS通過Toll 4介導(dǎo)炎性因子的分泌[16-17]

2 莢膜(capsula)

莢膜是分泌至菌體外的一類以多糖或多肽為主的物質(zhì)，在細(xì)菌-宿主致病過程中起重要作用，如黏附、細(xì)菌擴(kuò)散、抵抗宿主先天性和特異性免疫系統(tǒng)、細(xì)菌胞內(nèi)生存和調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的細(xì)胞因子等，不同Pm莢膜血清型中莢膜的主要成分和作用不同(表1)。莢膜能夠促進(jìn)Pm的細(xì)胞黏附能力。BORRATHYBAY等[18]發(fā)現(xiàn)Pm莢膜中一種39 kDa的特異性蛋白能顯著增強(qiáng)Pm對(duì)雞成纖維細(xì)胞的黏附能力。另外，莢膜的有無決定了Pm的致病能力，有莢膜菌株對(duì)吞噬細(xì)胞的抵抗能力遠(yuǎn)高于無莢膜菌株，莢膜缺失突變株的毒力也低于野生株。研究表明，Pm莢膜是躲避中性粒細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞吞噬作用的重要免疫逃避因子[19]。Pm莢膜的缺失會(huì)降低Pm對(duì)抗補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬殺傷作用，導(dǎo)致致病力顯著性降低[20]。CHUNG等[21]將四環(huán)素抗性基因插入A:1型Pm X-73菌株的hexA基因后，X-73株不能產(chǎn)生莢膜，對(duì)雞的致病力明顯減弱。

表1 不同莢膜血清型中莢膜的主要成分和作用

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，Pm莢膜合成相關(guān)基因hyaC的點(diǎn)突變、Pm0442基因的缺失、群體感應(yīng)基因qseC和luxS的缺失，以及編碼假定三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素蛋白(TAA)的chr_orf01597基因的缺失，都會(huì)顯著影響莢膜產(chǎn)量，降低Pm致病能力(未發(fā)表數(shù)據(jù))。研究還發(fā)現(xiàn)，牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ2)感染巨噬細(xì)胞后能通過激活NLRP3炎性小體(NLRP3 inflammasome)和天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)，促進(jìn)IL-1β的成熟及分泌[24]。進(jìn)一步地，相較于PmCQ2，弱毒株P(guān)mCQ6莢膜含量少，更易被吞噬，對(duì)NLPR3炎性小體的激活程度也更高，進(jìn)而誘導(dǎo)更高水平IL-1β的分泌[25]。

3 外膜蛋白(OMPs)

外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是主要的毒力因子之一，包括結(jié)構(gòu)蛋白(OmpA、Omp28、Oma87)、外膜通道蛋白(OmpH、OmpW)、脂蛋白(PlpB、PlpE和Omp0979)、鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白(IROMPs)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)合蛋白、黏附素、蛋白質(zhì)組裝器、孔蛋白和三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，多數(shù)OMPs具有抗吞噬作用。研究發(fā)現(xiàn)給牛皮下接種B:2型Pm的OMPs提取物，可引起出血性敗血癥，并對(duì)牛致死[26]。

Pm的OMPs跨膜區(qū)域?yàn)棣?折疊，由偶數(shù)個(gè)β-分子反向折疊成β-桶狀結(jié)構(gòu)，將OMPs錨定在外膜上，部分β-桶狀結(jié)構(gòu)可作為離子通道，是一類作用于營養(yǎng)攝取、物質(zhì)運(yùn)輸、感染宿主和激發(fā)免疫應(yīng)答等過程的高免疫原性蛋白，具有良好的抗原性和免疫原性，常作為重要的疫苗候選抗原[27]。以O(shè)MPs制備的疫苗對(duì)小鼠、雞和兔都有明顯的保護(hù)力[28]。不同OMPs在不同血清型菌株中的種類、結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)特性存在差異(表2)。

表2 OMPs的種類、結(jié)構(gòu)、功能和免疫學(xué)特性

續(xù)表2

4 多殺性巴氏桿菌毒素(PMT)

多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是一種由D型和少數(shù)A型產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(toxigenicPasteurellamultocida，T+Pm)產(chǎn)生的皮膚壞死毒素，能引起豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎，本質(zhì)是一種高活性的有絲分裂原。PMT可與破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、T細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和纖維母細(xì)胞上的受體結(jié)合，影響其生長分化。PMT可阻斷成骨細(xì)胞的進(jìn)行性變性，使鼻甲骨的生長、合成與吸收失衡[50-53]。當(dāng)PMT達(dá)到一定濃度時(shí)，促進(jìn)纖維原細(xì)胞和造骨細(xì)胞的DNA合成，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的前體大量生長，提高骨的吸收能力，使細(xì)胞骨架重排，如引發(fā)豬的進(jìn)行性萎縮性鼻炎。PMT可制備成類毒素保護(hù)小鼠及其后代抵抗PMT。通過基因修飾置換掉PMT的2個(gè)關(guān)鍵氨基酸，新翻譯的無毒性蛋白可保護(hù)野生型毒株對(duì)豬的感染?？诜MT和硫醇鹽丙烯酸樹脂微粒(TEMS)混合制備成的W/O/W乳劑，前者能在后者的包裹下緩慢釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和NO，增強(qiáng)疫苗的免疫作用[54]。

PMT通過激活Galphaq/11家族的異源三聚體G蛋白，與鳥嘌呤核苷酸交換因子(p63 RhoGEF)發(fā)生特異性反應(yīng)，激活RhoA蛋白，活化的RhoA在Rho激酶的幫助下，可以刺激有絲分裂原激活蛋白(MAP)，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該過程涉及到原癌基因(Ras)、MAPK/ERK激酶1(MEK-1)和細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶1/2(ERK1/2)，改變相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制骨細(xì)胞的分化(圖3A)。

除了由RhoA蛋白介導(dǎo)的PMT致病通路外，還存在由G蛋白q家族的α亞基(Gαq)這個(gè)高度專一的直接靶點(diǎn)介導(dǎo)的致病通路。具體通路是：PMT先通過脫酰胺基和磷酸化作用激活α亞基，三聚體G蛋白復(fù)合物隨之解開，再通過JAK-STAT通路激活磷酸肌醇特異性磷脂酶C-β1(PLCβ1)和顆粒酶A，顆粒酶A切割I(lǐng)L-1β前體形成成熟的IL-1β?；罨腃-β1通過水解磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2)形成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)及二酰基甘油(DAG)，IP3和DAG可結(jié)合細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+和蛋白酶C(PKC)，從而抑制成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用(圖3B)。

A．RhoA蛋白介導(dǎo)；B.C-β1介導(dǎo)圖

5 黏附相關(guān)因子

對(duì)細(xì)胞的黏附作用是Pm定殖和感染宿主的前體條件，其中起主導(dǎo)作用的是莢膜、菌毛和一些黏附相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)PlpB蛋白與Pm對(duì)雞成纖維細(xì)胞的黏附力密切相關(guān)，該蛋白影響Pm的毒力、致病性和對(duì)細(xì)胞的附著能力，發(fā)揮黏附因子作用，可以調(diào)節(jié)IL-1、IL-3、IL-4、TNF-α和TNF-β等炎性因子的分泌[18]。除雞成纖維細(xì)胞外，PlpB也有助于增強(qiáng)Pm對(duì)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用[58]。PRUIMBOOM等[59]在研究Pm對(duì)火雞巨噬細(xì)胞的附著機(jī)制發(fā)現(xiàn)，向巨噬細(xì)胞中添加透明質(zhì)酸可抑制Pm黏附，用透明質(zhì)酸酶解聚Pm莢膜可增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力，同時(shí)降低Pm的黏附能力、抗吞噬能力和致病性。證明莢膜的有效成份透明質(zhì)酸在Pm黏附過程發(fā)揮重要作用。

Ⅳ型菌毛(PtfA)廣泛存在于A、B、D型Pm中，與宿主嗜性和致病性密切相關(guān)，被認(rèn)為是潛在毒力因子之一[60]。Pm70基因序列中也包含多種能編碼類似菌毛功能的黏附相關(guān)基因，如HadA、fimA、flp1、flp2、Hsf-1、Hsf-2等。由他們編碼的相關(guān)蛋白如：黏附素A(HadA)、自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素1(Hsf-1)、自轉(zhuǎn)運(yùn)黏附素2(Hsf-2)都能影響Pm的定殖和感染[61]。

6 絲狀血球凝集素蛋白(PfhB)

血球凝集素家族的PfhB存在于多種細(xì)菌和病毒表面，參與細(xì)胞的識(shí)別和附著，能夠?qū)Ｒ磺铱赡娴亟Y(jié)合到特異性單(多)糖上。Pm具有PfhB1和PfhB2(或稱為FhaB1和FhaB2)2種絲狀血凝素，與生物被膜形成、Pm定殖和毒力有關(guān)。PfhB1和PfhB2功能的缺失，可以顯著降低Pm的毒力作用[62]。主要由于pfhb1和pfhb編碼的肽酶C58結(jié)構(gòu)域具有細(xì)胞毒性，而致病因子PfhB1和PfhB2上都包含肽酶C58結(jié)構(gòu)域、血凝素活性結(jié)構(gòu)域和血凝素重復(fù)結(jié)構(gòu)域[63]。

pfhb1和pfhb2在Pm最初的入侵和定殖中發(fā)揮重要作用。敲除pfhb1會(huì)導(dǎo)致禽源菌株C48-102毒力下降，并降低Pm對(duì)補(bǔ)體的抵抗作用。誘變pfhb1并對(duì)火雞鼻內(nèi)接種，發(fā)現(xiàn)pfhb1的失活可顯著降低禽源菌株P(guān)-1059的致病力；改為肌肉接種，其毒力同樣適度減弱。誘變禽源A:3型Pm菌株的pfhb2后感染火雞，不管是鼻內(nèi)接種還是靜脈注射，pfhb2的失活均顯著降低了Pm的致病力，且鼻內(nèi)接種的降低程度更顯著。敲除pfhb2亦會(huì)降低禽源菌株P(guān)-1059的毒力，但不影響對(duì)補(bǔ)體的抵抗作用[64]。突變P-1059菌株的pfhb2后感染小鼠，發(fā)現(xiàn)菌株完全減毒[65]，以Pm的FHAB2多肽重組體免疫火雞，可以對(duì)不同血清型的Pm產(chǎn)生免疫保護(hù)性，除PfhB1和PfhB2外，PfhB6同樣能對(duì)單一血清型提供保護(hù)，且在多種血清型中保守性較高[66]。

7 蛋白酶及其他

Pm可通過抑制抗體活性逃避宿主的免疫機(jī)制，促進(jìn)定殖和感染[67]。其中發(fā)揮主要作用的是Pm分泌的蛋白酶，它作用的底物是免疫球蛋白IgG和IgA，能夠降低這些抗體的活性和水平。目前研究的其他毒力因子還包括神經(jīng)氨酸酶(NanB、NanH)、超氧化物歧化酶(sodA、sodC)、緊密黏附蛋白(TadD)、透明質(zhì)酸酶(Pm HAS)、菌毛亞單位蛋白(FimA)、皮膚壞死毒素(ToxA)等[68]。

本實(shí)驗(yàn)室前期建立的牛源A型PmCQ2感染小鼠肺炎模型發(fā)現(xiàn)，相較于其他毒力基因，Pm0442基因和qseC基因可在PmCQ2感染小鼠的肺臟中大量表達(dá)。同野生型菌株比，PmCQ2-Δ0442的莢膜含量、黏附、入侵以及毒力均下降。PmCQ2-ΔqseC的莢膜含量、毒力和在小鼠肺部的定殖量同樣極顯著降低。推測(cè)Pm0442基因和qseC基因是PmCQ2的毒力相關(guān)基因(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

8 總結(jié)與展望

目前，Pm仍是威脅畜禽養(yǎng)殖業(yè)和人類公共衛(wèi)生安全的重要病原菌之一，其致病性可能是多種毒力因子協(xié)同作用的結(jié)果。不同血清型的Pm抗原性、宿主特異性和致病機(jī)理不同，感染后臨床癥狀也不相同，毒力因子的具體作用機(jī)制也有待深入研究。很多毒力因子被證實(shí)與Pm的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、定殖、入侵等過程有關(guān)。多種菌體蛋白被認(rèn)為是疫苗開發(fā)中的潛在靶抗原，如OmpA、OmpH、PlpB和PlpE都具有良好的免疫保護(hù)作用，可作為預(yù)防和治療多殺性巴氏桿菌病的新型疫苗候選靶標(biāo)?；谶@些毒力因子的研究，有助于闡明Pm的致病機(jī)理，促進(jìn)疫苗的研制，減少畜禽養(yǎng)殖中因多殺性巴氏桿菌病引起的經(jīng)濟(jì)損失。