附睪結(jié)構(gòu)及其功能研究進(jìn)展

朱文倩，張學(xué)明

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 動(dòng)物胚胎工程吉林省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

精原細(xì)胞在睪丸中通過有絲分裂、減數(shù)分裂和變態(tài)發(fā)育成為分化完全的精子后并未完全成熟，需經(jīng)直精小管、睪丸網(wǎng)、輸出小管進(jìn)入附睪管，循附睪頭、體、尾移行，與附睪管腔的微環(huán)境相互作用，進(jìn)一步發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，獲得運(yùn)動(dòng)能力、透明帶固著能力、精卵識(shí)別和結(jié)合能力，完成成熟過程并靜息儲(chǔ)存于附睪尾[1]。

1 附睪的結(jié)構(gòu)

1.1 輸出小管和附睪管附睪起源于胚胎中腎管(沃爾夫管)的形成，直至分化為迂曲的管腔[2]，主要由輸出小管、附睪管和管間結(jié)締組織構(gòu)成，附著于睪丸的上端和后緣，可分為頭、體和尾3個(gè)區(qū)段[3]，在小鼠、大鼠等種屬，附睪頭部近端還有起始段。其中，頭部和體部分別調(diào)控早期和晚期的精子成熟，而尾部主要是成熟精子的儲(chǔ)存部位[4-5]。附睪管黏膜上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮，一般包含主細(xì)胞、基細(xì)胞、亮細(xì)胞、頂細(xì)胞(狹窄細(xì)胞)等亞型細(xì)胞[6]。主細(xì)胞是附睪上皮中主要的細(xì)胞類型，占上皮細(xì)胞數(shù)量比例的80%左右，存在于附睪的各個(gè)區(qū)段，胞質(zhì)中含有豐富的細(xì)胞器和分泌囊泡[7]，有活躍的內(nèi)吞作用，參與管腔大部分蛋白的合成與分泌[4]?；?xì)胞呈圓錐形，位于上皮的基底膜，大鼠基細(xì)胞通過形態(tài)改變可調(diào)節(jié)管腔的體積和管壁壓力，表明其對附睪管腔結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[7]。亮細(xì)胞體積較大，分布于附睪各個(gè)區(qū)段，在人、大鼠等種屬中均有發(fā)現(xiàn)，能吞噬精子碎屑，清潔管腔環(huán)境[7]。頂細(xì)胞數(shù)量很少；其頂部寬、體部窄，胞核位于頂部；細(xì)胞頂端腔面呈圓頂狀，有短而少的微絨毛；胞質(zhì)中含有許多大而不規(guī)則的線粒體，其他細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。頂細(xì)胞和亮細(xì)胞的頂質(zhì)區(qū)表達(dá)液泡質(zhì)子泵ATP酶(V-ATPase)[6]，可依賴分解ATP產(chǎn)生的能量作為動(dòng)力，泵出質(zhì)子H+參與維持管腔內(nèi)的酸化環(huán)境[8]。此外，附睪上皮基膜外側(cè)還包繞有平滑肌層，參與精子運(yùn)輸[9]。

1.2 血-附睪屏障血-附睪屏障(blood-epididymis barrier,BEB)是存在于附睪管內(nèi)與管壁外結(jié)締組織中毛細(xì)血管間可調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)出、提供精子成熟微環(huán)境、阻止管內(nèi)自體免疫反應(yīng)發(fā)生的結(jié)構(gòu)(圖1)[10]。其結(jié)構(gòu)和功能包括形態(tài)結(jié)構(gòu)(物理性)、生理功能(滲透性)和免疫屏障3個(gè)方面。

圖1 附睪上皮結(jié)構(gòu)模式圖

BEB的組織學(xué)構(gòu)成主要是附睪上皮及其細(xì)胞連接(特別是緊密連接tight junction,TJ)、基膜、平滑肌、毛細(xì)血管內(nèi)皮及其基膜。電鏡研究顯示，附睪上皮間存在的網(wǎng)狀TJ可有效阻止辣根過氧化物酶、鑭等分子進(jìn)入管腔；小鼠管外平滑肌半透膜則可阻止碳顆粒、鑭等分子進(jìn)入85%～90%的管腔內(nèi)。附睪上皮游離面和基底面的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)分子進(jìn)出管內(nèi)，形成特定微環(huán)境。BEB滲透屏障的結(jié)構(gòu)在精子成熟過程中呈動(dòng)態(tài)變化，但上皮細(xì)胞間連接的完整性基本不變。BEB的免疫屏障功能主要是隔絕精子抗體、限制免疫球蛋白和免疫細(xì)胞進(jìn)入管腔，從而保護(hù)精子免受自身免疫系統(tǒng)的攻擊。正常條件下，單核吞噬細(xì)胞(mononuclear phagocytes,MPs)、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞在附睪管外結(jié)締組織中廣泛存在，但管內(nèi)未見存在；同樣，管內(nèi)也未檢測到大部分的免疫球蛋白。即使管外發(fā)生炎癥，管內(nèi)微環(huán)境仍能保持一定穩(wěn)定性。

2 附睪的功能

2.1 轉(zhuǎn)運(yùn)作用輸出小管上皮由單層立方細(xì)胞和柱狀纖毛細(xì)胞交替排列，纖毛細(xì)胞游離面有長纖毛伸入管腔，非纖毛細(xì)胞腔面凸向管腔，有微絨毛。這些特化結(jié)構(gòu)的擺動(dòng)參與精子的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。延時(shí)成像監(jiān)測發(fā)現(xiàn)附睪頭部和體部管壁呈規(guī)律性和階段性收縮模式，調(diào)控精子在附睪管中轉(zhuǎn)運(yùn)的時(shí)間，確保精子結(jié)構(gòu)和功能的完善[12]。大鼠附睪頭部還存在5-羥色胺能系統(tǒng)，可作為神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)附睪平滑肌的收縮活動(dòng)，參與調(diào)節(jié)精子轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。附睪精子的轉(zhuǎn)運(yùn)同樣受旁分泌或內(nèi)分泌因子的調(diào)控，催產(chǎn)素、去甲腎上腺素等可增強(qiáng)附睪平滑肌收縮[12]，而cGMP信號(hào)則對附睪管平滑肌具有松弛作用[9]；在附睪尾部，平滑肌層受節(jié)后交感神經(jīng)纖維支配，促進(jìn)附睪精子向輸精管方向的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。上述研究表明，附睪內(nèi)精子的轉(zhuǎn)運(yùn)受到特化纖毛和微絨毛擺動(dòng)及平滑肌收縮的協(xié)同調(diào)控，形成從睪丸向附睪的液體流，推動(dòng)精子的遷移[15]。

2.2 重吸收作用研究表明，約95%睪丸網(wǎng)內(nèi)液體的重吸收主要是通過附睪頭部輸出小管的上皮細(xì)胞完成的[15]。蛋白質(zhì)量濃度在附睪初始段約為4 g/L，而在附睪尾部可增至50～60 g/L[16]，表明附睪存在可觀的重吸收能力。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一類同源性的內(nèi)在膜蛋白，在細(xì)胞膜上形成特異性水轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，驅(qū)動(dòng)水和中性溶質(zhì)分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[17]，維持機(jī)體水和電解質(zhì)平衡。AQP1/9是輸出小管和附睪管中最豐富的水通道蛋白，在附睪的分泌和重吸收過程中發(fā)揮重要作用[18]。AQP1在絕大部分哺乳動(dòng)物包括人的輸出小管、附睪起始段上皮細(xì)胞的頂質(zhì)膜和附睪頭部非纖毛細(xì)胞的微絨毛中均有分布[18-19]，參與精子成熟過程中睪丸網(wǎng)液體的大量重吸收。AQP9在附睪各區(qū)段主細(xì)胞的頂部均有表達(dá)[19-20]，但在附睪頭部和尾部的表達(dá)較高。這表明附睪各區(qū)段重吸收能力存在差異，頭部是附睪的主要重吸收部位，而尾部是成熟精子及液體濃縮、儲(chǔ)存的部位[17]。因此AQP1/9的表達(dá)和調(diào)節(jié)與附睪的重吸收作用密切相關(guān)。

2.3 免疫作用附睪上皮的MPs包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等專職抗原呈遞細(xì)胞[21]，在起始段，CD11c+CX3CR1+上皮細(xì)胞的長突起可直接獲得管腔中的抗原，參與附睪的免疫監(jiān)視[22-23]。成年小鼠附睪單側(cè)輸出小管結(jié)扎后，引起附睪起始段上皮細(xì)胞迅速凋亡，原位檢測發(fā)現(xiàn)附睪上皮中CD11c+CX3CR1+的MPs通過表型和形態(tài)的改變及時(shí)吞噬凋亡細(xì)胞和炎性碎屑，維持BEB的TJs結(jié)構(gòu)的完整性[21]。應(yīng)用家系全外顯子組測序技術(shù)在梗阻性無精子癥患者的附睪TJs編碼基因CLDN2中發(fā)現(xiàn)了一種新的功能獲得性錯(cuò)義變體，該突變位點(diǎn)與家系中顯示的X連鎖遺傳模式相一致，皆因附睪上皮細(xì)胞間TJs被破壞，干擾了BEB的正常功能，引發(fā)附睪上皮炎癥性碎屑脫落，造成機(jī)械性梗阻[24]。上述研究表明，附睪上皮細(xì)胞形態(tài)和功能的正常維持對BEB的免疫防御作用至關(guān)重要[22]，附睪上皮結(jié)構(gòu)改變或附睪管腔阻塞都有可能導(dǎo)致雄性不育。

2.4 修飾作用精子在睪丸中完成形態(tài)分化后進(jìn)入附睪，穿行過程中被連續(xù)修飾，包括精子胞漿小滴(cytoplasmic droplet,CD)的移行、精子胞漿和頂體形態(tài)變化、精子核染色質(zhì)的濃縮、精子質(zhì)膜表面蛋白構(gòu)象的改變等[25-26]。

2.4.1精子形態(tài)變化 CD是精子進(jìn)入附睪前經(jīng)支持細(xì)胞吞噬胞質(zhì)后的殘余體[27]，與精子滲透調(diào)節(jié)和運(yùn)動(dòng)有關(guān)。由于精子中缺少滲透調(diào)節(jié)的細(xì)胞器，位于中段的CD參與調(diào)控水和滲透物質(zhì)的運(yùn)輸，介導(dǎo)調(diào)節(jié)性容積減小或增大的過程[28]，成為精子滲透調(diào)節(jié)的主要場所[29]。研究發(fā)現(xiàn)，來源于附睪頭部的精子，CD位于精子頭-頸連接中段的近端；而在附睪尾部或輸精管獲得的精子，CD位于精子鞭毛中段的末端，表明精子在附睪內(nèi)移行的過程中，CD逐漸從精子頸部向尾部轉(zhuǎn)運(yùn)；且精子CD的缺失或異位可引起精子活力降低或形態(tài)改變，導(dǎo)致雄性不育[30]。因此，該結(jié)構(gòu)在精子運(yùn)動(dòng)、超激活運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用，可能成為研究雄性避孕的理想藥物靶標(biāo)。

2.4.2精子表面蛋白變化 附睪小體是附睪上皮細(xì)胞以頂漿分泌方式產(chǎn)生的納米膜狀囊泡[5]，通過轉(zhuǎn)運(yùn)精子成熟和受精所需的蛋白促進(jìn)精子成熟。附睪小體能包裹多種附睪上皮區(qū)域性的分泌蛋白并將其轉(zhuǎn)移至精子[25]。在分子水平上，附睪中精子生理功能的改變與磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的激活相關(guān)，通過激活cAMP/PKA通路介導(dǎo)酪氨酸磷酸化的增加，與精子獲能密切相關(guān)[31]。其中，cSrc是參與該過程的酪氨酸激酶，由附睪小體釋放并遞送至精子。另外，小泛素相關(guān)修飾蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)可與雄激素受體AR結(jié)合，參與細(xì)胞周期、分化和凋亡的調(diào)控[32]。消除AR的SUMO化引起附睪內(nèi)117個(gè)基因差異表達(dá)，其中受雄激素調(diào)控的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子Pem/Rhox5和絲氨酸肽酶抑制因子Spink2/5/11表達(dá)降低，導(dǎo)致附睪精子成熟障礙、精子活力降低和精卵結(jié)合能力受損[33]。這表明AR的SUMO化能特異性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，維持正常附睪功能和精子成熟。

2.4.3附睪分泌蛋白與精子成熟 P34H是由附睪上皮細(xì)胞分泌并通過糖基磷脂酰肌醇錨定于精子頂體部位的膜蛋白，與倉鼠附睪蛋白P26H具有較高的同源性。P34H/P26H與附睪小體的筏膜結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，介導(dǎo)精子與透明帶的結(jié)合，是附睪精子成熟的標(biāo)志之一，低水平的P34H與雄性不育有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，倉鼠附睪頭部精子中未檢測到P26H，而附睪尾部精子則顯著表達(dá)該分子，表明P34H/P26H是在附睪精子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中轉(zhuǎn)移至精子表面的[25]。

富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine rich secretory proteins,CRISP)中CRISP1/4是由附睪上皮合成分泌的雄激素依賴蛋白，參與附睪中精子成熟的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和調(diào)控精子超活化運(yùn)動(dòng)等[34]。研究發(fā)現(xiàn)，CRISP1/4單敲小鼠可育，但雙敲小鼠則表現(xiàn)為附睪多個(gè)區(qū)段的上皮細(xì)胞損傷，且管內(nèi)pH顯著升高，表明CRISP1/4的同源蛋白間存在補(bǔ)償機(jī)制，參與調(diào)控附睪上皮細(xì)胞的分化，維持精子成熟和儲(chǔ)存所需的管內(nèi)pH酸化水平[34]；CRISP1也參與調(diào)控Ca2+信號(hào)通路，在精子獲得前向運(yùn)動(dòng)、精子超活化運(yùn)動(dòng)和精卵結(jié)合能力的過程中發(fā)揮重要作用[35]。

2.5 保護(hù)作用活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細(xì)胞氧化還原代謝的副產(chǎn)物，適量ROS通過調(diào)節(jié)附睪中cAMP水平在精子成熟、獲能和頂體反應(yīng)等過程中起核心作用，過量ROS會(huì)引起精子質(zhì)膜不飽和脂肪酸鏈過度氧化交聯(lián)，損害精子功能，影響雄性生育力。?；撬崾歉讲G液中主要的游離氨基酸，是重要的滲透調(diào)節(jié)器和抗氧化劑，對精子具有滲透調(diào)節(jié)、保持Ca2+動(dòng)態(tài)平衡、防止脂質(zhì)過氧化的作用[36]。半胱氨酸雙加氧酶(cysteine dioxygenase,CDO)是合成牛磺酸的關(guān)鍵酶，CDO-/-小鼠的附睪液和精子中?；撬崴絿?yán)重降低，精子因滲透調(diào)節(jié)能力的降低引起鞭毛形態(tài)改變，導(dǎo)致受精率降低[36]。此外，?；撬徇€通過提高過氧化酶的活性防止線粒體產(chǎn)生自由基引起精子的氧化應(yīng)激。谷胱甘肽過氧化物酶5(glutathione peroxidase-5,GPX5)是在附睪中特異性表達(dá)的抗氧化酶，參與調(diào)節(jié)附睪微環(huán)境中的ROS濃度[37]。精子在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，GPX5與精子膜結(jié)合保護(hù)精子免受脂質(zhì)過氧化損傷，以維持精子DNA的完整性和穩(wěn)定性，抑制附睪尾部精子頂體反應(yīng)過早發(fā)生的同時(shí)，協(xié)調(diào)精核谷胱甘肽過氧化物酶-4(snGPx4)發(fā)揮穩(wěn)定核染色質(zhì)和維持其致密化的作用[38]，并通過附睪小體泛素轉(zhuǎn)移來幫助消除功能缺陷的精子[31]，保證精子正常的發(fā)育、成熟[37]。

2.6 儲(chǔ)存作用附睪的精子儲(chǔ)存作用雖已習(xí)為人知，但有關(guān)人、靈長類和試驗(yàn)動(dòng)物方面尚缺乏最新文獻(xiàn)資料。與哺乳動(dòng)物相比，爬行動(dòng)物精子在附睪儲(chǔ)存的時(shí)間更長，由于爬行動(dòng)物特殊的生殖習(xí)性，使精子發(fā)生與排卵時(shí)間相互錯(cuò)位。這對于比較研究哺乳類包括男性附睪的精子儲(chǔ)存作用可能有借鑒意義。研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉附睪中的精子含有較多的胞質(zhì)[39]，且雌性輸卵管中也觀察到未成熟的精子，表明其附睪精子的成熟度較低，所以附睪在爬行動(dòng)物中主要起儲(chǔ)存精子作用。中華鱉的生精活動(dòng)隨季節(jié)變化，精子發(fā)生的各個(gè)階段早在冬季來臨之前完成[40]，之后儲(chǔ)存于附睪中直至次年繁殖季節(jié)[39-41]。中華鱉附睪外泌體由上皮纖毛細(xì)胞、腺體細(xì)胞通過頂漿分泌方式和多泡體釋放至管腔，介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊。其特異性標(biāo)記物CD63在精子儲(chǔ)存期間的表達(dá)顯著高于繁殖期，表明附睪外泌體可能參與精子的儲(chǔ)存過程[42]。此外，免疫調(diào)節(jié)也是影響精子在附睪儲(chǔ)存的重要因素。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的介導(dǎo)免疫反應(yīng)的分子。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2/4在中華鱉附睪各區(qū)段和精子中均有表達(dá)[43]，TLR2/4在儲(chǔ)存期和繁殖期精子中的分布位置差異不大，但TLR4在儲(chǔ)存期和繁殖期附睪尾部的表達(dá)顯著高于頭部和體部，表明TLR2/4可能在維持附睪微環(huán)境和保護(hù)精子免受外源微生物感染方面發(fā)揮作用。

3 總結(jié)與展望

附睪及附睪精子成熟具有重要的研究價(jià)值，了解附睪的結(jié)構(gòu)和功能，闡明精子成熟過程中的復(fù)雜機(jī)制，將為揭示附睪源性雄性不育疾病的遺傳及發(fā)生機(jī)理奠定良好的理論基礎(chǔ)，對實(shí)現(xiàn)雄性生育力的調(diào)節(jié)和精子受精率的提升具有指導(dǎo)意義。