永生化犬骨髓間充質(zhì)干細胞株的建立

陳奕靜，戴鵬秀，張露文，李佳鍇，張翊華

(西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊陵 712100)

近年來，越來越多的家庭開始重視寵物的健康，雖然現(xiàn)代寵物醫(yī)療有了很大的提高，但仍有許多嚴重的疾病不能通過臨床治療手段解決。干細胞療法是臨床實踐中的創(chuàng)新,間充質(zhì)干細胞(MSCs)位于受損部位，分化為組織特有的細胞，并有助于組織修復(fù)[1]。利用骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)進行臨床疾病治療是具有廣闊前景的研究領(lǐng)域[2]。與其他干細胞的不同之處在于，它們不僅可分化為相同的中胚層譜系，如骨骼、軟骨和脂肪細胞，而且還可分化為其他外胚層和內(nèi)胚層譜系[3]，因此，BMSCs是成體干細胞的獨特類型。

BMSCs具有多向分化潛能、免疫原性及歸巢能力，并且取材較為方便，動物骨髓可再生，因此是組織工程種子細胞的首要選擇[4]。但BMSCs在骨髓中含量非常有限，體外培養(yǎng)周期短，如果不能盡快使用成功分離的BMSCs，待其傳過多代后，各項性能將會明顯下降，無法進行下一步研究和應(yīng)用[5]。建立永生化細胞株可以使體外培養(yǎng)的細胞無限繁殖并且細胞間不存在差異。自發(fā)性永生化幾率十分小，可利用基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)提高永生化的發(fā)生率，以此來建立永生化細胞株。因此，本試驗將構(gòu)建好的pLOX-Ttag-iresTK慢病毒載體包裝后感染犬cBMSCs，連續(xù)培養(yǎng)傳至50代，并通過細胞形態(tài)觀察、細胞計數(shù)、RT-qPCR基因表達分析、Western blot以及流式和三系分化鑒定，建立永生化犬骨髓間充質(zhì)干細胞(cBMSCs)，為臨床疾病治療研究提供材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和試驗材料質(zhì)粒pLOX-Ttag-iresTK、pLP/PsPAX、pLP/VSVG(Addgene公司)；Stbl3感受態(tài)細胞(北京華越洋生物科技有限公司)；293T細胞和cBMSCs由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院外科實驗室保存[6]；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(杭州博日科技有限公司)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，Japan)；BOSTER Western blot檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)；Asvanced Transfection Reagent、胎牛血清(FBS)(ZETA LIFE，USA)、α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；犬骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導分化完全培養(yǎng)液、成骨誘導培養(yǎng)液、軟骨誘導完全培養(yǎng)液(賽業(yè)生物科技有限公司)。

1.2 cBMSCs的復(fù)蘇與培養(yǎng)傳代使用α-MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇實驗室凍存的第3代cBMSCs，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。待其長至80%～90%融合時，用胰酶消化，待90%的細胞變圓時吸出胰酶，加入2 mL α-MEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，吹打細胞后按1∶2傳代，十字形晃動培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，平均3 d傳1代。

1.3 包裝攜帶SV40基因的慢病毒分別將包裝質(zhì)粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和質(zhì)粒pLOX-Ttag-iresTK轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細胞中，將菌液涂布在LB培養(yǎng)基(含100 mg/L 卡那霉素)上，37℃培養(yǎng)箱中倒置平板過夜培養(yǎng)。待質(zhì)粒擴增后，用天根試劑盒提取質(zhì)粒。以1×106個/mL的密度將293T細胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細胞融合至60%左右時，將包裝質(zhì)粒pLP/PsPAX 2.8 μg、pLP/VSVG 2.0 μg和質(zhì)粒pLOX-Ttag-iresTK 1.8 μg與10.0 μL轉(zhuǎn)染試劑Asvanced Transfection Reagent混合，混勻后靜置10 min，逐滴將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加至培養(yǎng)皿中。24 h后，換入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清并進行滴度測定。

1.4 永生化cBMSCs株的構(gòu)建cBMSCs融合度達到60%時，將收集的慢病毒上清液和α-MEM培養(yǎng)液按照1∶1的體積比例換至cBMSCs進行轉(zhuǎn)染；8 h 后吸出液體加入3 mL α-MEM培養(yǎng)液，48 h使用4 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cBMSCs傳代，用α-MEM(含10% FBS)進行培養(yǎng)，37℃、5%CO2條件下，連續(xù)傳超過50代后，即可得到永生化的cBMSCs株。

1.5 永生化cBMSCs株的鑒定

1.5.1細胞生長曲線和群體倍增時間的測定 在相差顯微鏡下觀察永生化cBMSCs的形態(tài)變化，并與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的cBMSCs進行比較。取第50代永生化cBMSCs和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的野生cBMSCs，以0.5×104個/孔的細胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，每天取3孔進行細胞計數(shù)，取所得到的平均值記作當天的細胞數(shù)，連續(xù)計數(shù)7 d，繪制其生長曲線。cBMSCs的群體倍增時間(PDT)根據(jù)公式PDT=T×[lg2/(lgNt-lgN0)]估算。N0為接種細胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)后的細胞數(shù)，T為培養(yǎng)時間，以h為單位。

1.5.2野生型和永生化第50代cBMSCs SV40的表達檢測 人工設(shè)計并合成1對片段大小為386 bp的特異性檢測引物(F：5′-TGACCTCCATAGAA-GACACCG-3′；R：5′-CAAATACCTCAGTTGCA-TCCC-3′)。按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書對第50代永生化cBMSCs和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的野生cBMSCs進行總RNA的提取，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix說明書配置反應(yīng)體系進行基因表達檢測。每個樣本基因檢測3個復(fù)孔，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行分析。用細胞裂解法提取野生型和永生化第50代的cBMSCs細胞內(nèi)總蛋白，BCA法鑒定蛋白濃度。按照BOSTER Western blot檢測試劑盒說明書對SV40T進行Western blot檢測，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.5.3永生化cBMSCs的分化潛能及表面標志鑒定 將第50代永生化cBMSCs按1×104個/cm2密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待融合至80%左右用成脂、成骨、成軟骨分化試劑盒進行誘導分化。誘導完成后分別使用油紅O染色液、茜素紅染液和阿利辛藍染液對細胞進行染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。將第50代永生化cBMSCs重懸，計算調(diào)整細胞密度，制成2×106個/mL的細胞懸液，取流式細胞儀專用管11個，分別加入100 μL細胞懸液，隨后分別加入FITC標記的CD105、CD14、CD166、CD29、CD44、CD45，PE標記的CD90、CD11、CD34抗體以及對照抗體各5 μL，避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞表面分子標記物。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，cBMSCs呈長梭狀，少數(shù)為多角形，貼壁生長。野生型在第10代時細胞形態(tài)明顯發(fā)生變化，生長緩慢，同期永生化細胞狀態(tài)良好，生長速度較快。永生化在第50代時細胞活力仍較高，與原代細胞形態(tài)無明顯差異，呈旋渦狀排列(圖1)。

A.野生型第10代；B.永生化第10代；C.永生化第50代

2.2 細胞生長曲線測定對永生化第50代及野生型cBMSCs進行細胞計數(shù)并繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示。2種細胞在培養(yǎng)過程中，均持續(xù)增殖呈“S”型狀態(tài)，且成功轉(zhuǎn)染SV40的永生化cBMSCs相對于野生型細胞潛伏期縮短，增殖較快且數(shù)量較多。永生化cBMSCs的群體倍增時間約為0.68 d，野生型cBMSCs的群體倍增時間約為0.97 d。

圖2 永生化cBMSCs第50代與野生型cBMSCs的生長曲線

2.3 野生型和永生化第50代cBMSCs SV40的RT-qPCR檢測和蛋白鑒定由圖3可見，永生化cBMSCs中SV40的mRNA表達水平較野生型極顯著升高(P<0.001)。使用GAPDH作為蛋白質(zhì)標準化內(nèi)參，對已經(jīng)轉(zhuǎn)染SV40的cBMSCs進行蛋白質(zhì)免疫印跡測定，結(jié)果顯示永生化cBMSCs成功表達SV40T抗原。

圖3 永生化與野生型cBMSCs SV40 RT-qPCR(A)和Western blot結(jié)果(B)

2.4 永生化cBMSCs流式細胞術(shù)檢測流式檢測結(jié)果如圖4所示，細胞表面分子CD105(97.0%)、CD90(93.4%)、CD166(98.8%)、CD29(92.2%)和CD44(93.6%)為陽性表達，而CD11(1.4%)、CD14(0.4%)、CD34(1.0%)和CD45(1.2%)為陰性表達。

A.空白對照組；B.陰性表面分子；C.陽性表面分子

2.5 永生化cBMSCs三系分化永生化cBMSCs經(jīng)成骨誘導后，可發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞變長或呈多邊形伸展，茜素紅染色可見橘紅色鈣化結(jié)節(jié)；經(jīng)成軟骨誘導后，細胞體積變大呈多邊形，阿爾新藍將軟骨相關(guān)蛋白染成藍色；經(jīng)成脂肪細胞誘導培養(yǎng)7 d后，細胞變短，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴，油紅O染液將胞內(nèi)脂滴染成紅色(圖5)。

A.cBMSCs成骨誘導后茜素紅染色；B.cBMSCs成軟骨誘導后阿爾新藍染色；C.cBMSCs成脂肪誘導后油紅O染色

3 討論

BMSCs可從成體骨髓獲取并非必須來自胚胎，因其來源廣泛，易于獲取，并且不涉及道德倫理問題,相較于其他干細胞有明顯優(yōu)勢。因其免疫調(diào)節(jié)能力的獨特性，有助于抑制移植后的排斥反應(yīng)，所以BMSCs被認為是組織工程和再生醫(yī)學的理想候選者。BMSCs在骨髓中含量非常有限，體外培養(yǎng)周期短，常因復(fù)制衰老而死亡限制了它們的試驗和臨床研究[7]。因此，永生化BMSCs的建立對于這些細胞的應(yīng)用十分有利。

除了自發(fā)性永生化，常用病毒轉(zhuǎn)染、端粒酶活化和癌基因轉(zhuǎn)染等方法促使永生化[8]。人乳頭瘤病毒和EB病毒易誘發(fā)細胞惡性轉(zhuǎn)化，原癌細胞永生化操作困難，因此最常用的永生化基因是SV40和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。SV40T抗原影響細胞周期檢查點，防止細胞凋亡衰老，并促使細胞增殖[9]。單獨轉(zhuǎn)染SV40不足以誘導哺乳動物細胞腫瘤的發(fā)生[10]。

程斌等[11]將含有SV40基因的真核表達載體導入BMSCs中，發(fā)現(xiàn)試驗組細胞的生長速率明顯高于對照組，且未發(fā)現(xiàn)成瘤性。AYALA-CUELLAR等[12]用SV40逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染ASCs使其永生化，與原始ASCs相比具有更高的集落形成潛能，并且群體倍增時間減少。ZHANG等[13]將SV40導入前軟骨細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，數(shù)量增加但端粒酶長度未明顯縮短，證明SV40能夠避免細胞凋亡。

我們成功通過轉(zhuǎn)染SV40構(gòu)建了cBMSCs永生化細胞株。通過細胞形態(tài)和生長曲線的觀察，野生型cBMSCs在傳代培養(yǎng)至第10代后有衰老死亡的跡象，細胞倍增時間明顯延長，增殖速度顯著下降，胞體形狀也出現(xiàn)變化，多角及不規(guī)則形比例變大。與野生型cBMSCs相比，永生化的cBMSCs具有更高的生長速率，保持“長梭狀”的細胞形態(tài)，并形成單克隆細胞群，傳至50代后細胞仍然生長良好，同他人培養(yǎng)傳代的細胞形態(tài)和生長曲線走向相似[14-15]，證明了永生化cBMSCs具有更好的增殖能力。RT-qPCR和Western blot結(jié)果表明本次試驗確定已將SV40轉(zhuǎn)入cBMSCs并成功表達。

目前，BMSCs的特異性表面標記物還未確定，但根據(jù)以往長期研究發(fā)現(xiàn)，相對穩(wěn)定的BMSCs高表達表面抗原標記包括CD105、CD29、CD44、CD106、CD166、CD90等，基本上不表達HLA-Ⅱ類抗原以及其刺激分子，如CD40、CD80、CD86、CD45、CD14、CD34、CD38，亦不表達CD11a、LFA-1等淋巴細胞表面抗原和造血干細胞標記分子[16]。CD44是參與細胞遷移和血管生成的透明質(zhì)受體[17-18]，而且它似乎與CD90在維持干性狀態(tài)方面也有功能上的關(guān)聯(lián)。CD45是一種跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，在T細胞和B細胞中作為抗原受體信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在造血譜系的所有發(fā)育階段高表達[12]。本試驗對永生化第50代cBMSCs表面標志物進行分析，結(jié)果顯示，細胞表達CD105、CD90、CD166、CD29、CD44，幾乎不表達 CD11、CD14、CD34、CD45，與文獻報道一致，表明構(gòu)建的永生化細胞符合BMSCs的生物學特性。

據(jù)報道，BMSCs具有自我更新及多向分化能力，可在特定的體內(nèi)外微環(huán)境下，分化為不同的組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、髓基質(zhì)、神經(jīng)元細胞、脂肪細胞、胰腺細胞、星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等[19]。與ASCs相比，其具有更高的成骨成軟骨分化能力[20]。我們測試了永生化cBMSCs在分化成骨、成軟骨、成脂肪方面的多能性，最終在各染色鏡檢所得圖像中發(fā)現(xiàn)各分化方向的特異性染色標志，說明本次所得永生化cBMSCs細胞株是具有多向分化能力的細胞株。同其他相似試驗所得誘導分化染色圖像對比，染色標志的呈現(xiàn)大同小異[21]，進一步確定得到的永生化cBMSCs具有分化潛能。

本研究通過轉(zhuǎn)染SV40建立穩(wěn)定的永生化細胞株，具有與原代細胞相似的特性，達到了使體外培養(yǎng)的BMSCs具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的，并且可以成為進一步研究細胞信號并了解其性質(zhì)的有效模型，幫助我們了解骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與衰老的分子機制，為研究疾病治療如控制腫瘤細胞增殖及器官移植等奠定基礎(chǔ)。