感染乙腦病毒小鼠腦組織的轉(zhuǎn)錄組變化分析

高明星，張金花，劉澤霖，周靜靜，胡薛英，張萬坡，程國富，谷長勤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是由庫蚊傳播的黃病毒屬的正鏈單鏈RNA病毒。JEV是一種神經(jīng)入侵性病毒，會導(dǎo)致血腦屏障通透性發(fā)生改變[1]。JEV進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，在腦內(nèi)復(fù)制和增殖，引起許多動物的腦炎和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅人類和其他動物的生命安全[2]。在臨床腦炎病例中，有20%～30%的病例是致命的，有30%～50%的恢復(fù)病例會有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[3]。雖然有商品化的疫苗，但JEV仍是亞洲病毒性腦炎的主要原因[4]，可能與各國免疫制度有關(guān)。

RNA-Seq技術(shù)，又被稱為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，已成為研究動物病毒傳染病與宿主相互作用的重要技術(shù)之一[5]。探索JEV的致病機理，可以為更好的預(yù)防和治愈乙型腦炎提供科學(xué)依據(jù)。已有研究用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析JEV感染巨噬細(xì)胞、敲除RIPK3基因小鼠和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后細(xì)胞因子和通路的變化[6-8]。然而至今很少有體內(nèi)乙腦病毒感染在基因轉(zhuǎn)錄水平上較全面的調(diào)控機制分析。

本研究以105PFU的P3株乙腦病毒感染6周齡BALB/c雌鼠，感染6 d后分別取對照組和感染組腦組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，分析體內(nèi)參與抗病毒過程的相關(guān)基因和途徑，為乙腦的發(fā)病機制及防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗動物乙型腦炎病毒P3株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈。病毒采取乳鼠腦內(nèi)擴增，空斑試驗測定病毒毒價。6周齡BALB/c雌鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心。

1.2 主要試劑和儀器JEV E蛋白單克隆抗體，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室曹勝波教授饋贈；HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔IgG購于基因科技有限公司；固體DAB購于武漢博士德生物公司；TRIzol購自南京諾維贊有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購于TaKaRa公司。Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡購于日本Nikon公司；熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.3 試驗設(shè)計及采樣將30只6周齡BALB/c雌鼠隨機分為2組，感染組(20只)腹腔注射105PFU JEV P3毒株0.5 mL，對照組(10只)腹腔注射同體積的DMEM。注射后5 d小鼠出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀。注射后6 d對照組小鼠隨機處死9只，感染組選取神經(jīng)癥狀明顯的9只小鼠剖殺。隨機3只小鼠腦組織混為1個樣本，每組3個樣本，共6個樣本。剩余小鼠處死。對照組樣本編號為CK-1、CK-2和CK-3，感染組樣本編號為T1-1、T1-2和T1-3，送廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行測序。剩余的腦組織固定于10%中性福爾馬林溶液中，用于組織學(xué)觀察。

1.4 組織病理學(xué)觀察和病毒抗原定位分析將上述固定完全的組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后制作石蠟切片，切片厚度4～5 μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦組織的組織病理學(xué)變化。

抗原定位采用免疫組化(IHC)的方法，具體步驟簡述如下：石蠟切片脫蠟至水；3%過氧化氫處理30 min，0.01 mol/L PBS洗滌2次；將玻片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，蒸汽熱修復(fù)，于95～100℃保持30 min，取出自然冷卻；PBS洗滌后，5%BSA封閉30 min，滴加JEV E 蛋白單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜；PBS洗滌后滴加HRP標(biāo)記的二抗室溫作用30 min，PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素襯染，中性樹膠封片。利用光學(xué)顯微鏡與圖像采集系統(tǒng)觀察并采集圖像。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

1.5.1腦組織RNA提取 采用TRIzol法對腦組織樣品進(jìn)行RNA的提取，經(jīng)檢測確定合格后得到轉(zhuǎn)錄組測序使用的總RNA。

1.5.2cDNA文庫構(gòu)建及測序 樣品提取總RNA后，對于真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入fragmentation Buffer使其成為短片段，再以短片段的mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第1鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第2鏈。經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A及測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeqTM進(jìn)行測序。

1.5.3差異基因的篩選 使用edgeR軟件對樣本間基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析，利用FDR與log2(FC)來篩選差異基因，篩選條件為FDR<0.01且|log2FC|>1。

1.5.4DEGs GO與KEGG注釋及富集分析 根據(jù)GO和KEGG注釋結(jié)果以及官方分類，對篩選出的差異基因(DEG)與GO數(shù)據(jù)庫中的分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)、生物學(xué)過程(BP)以及KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，同時進(jìn)行富集GO條目篩選和Pathway顯著性篩選。

1.5.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)驗證 根據(jù)1.5.4分析結(jié)果，選擇8個與JEV進(jìn)入機體和復(fù)制有關(guān)的差異基因，進(jìn)行RT-qPCR定量驗證。其中與免疫相關(guān)的Trim25顯著上調(diào)，Hes5、P2ry12、Bpifa1和Cd4顯著下調(diào)；與炎癥相關(guān)的基因TNF-α、SOCS1和SOCS3顯著上調(diào)。反應(yīng)的引物序列如表1。應(yīng)用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。擴增條件：預(yù)變性95℃ 30 s；進(jìn)入循環(huán)，95℃ 5 s，56℃ 30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線分析，95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。計算出的Ct采用2-ΔΔCt法計算基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 差異基因 Q-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 JEV感染小鼠的腦組織病理變化及病毒抗原的定位鏡下觀察腦組織，對照組小鼠腦組織無明顯病理變化(圖1A)，而JEV感染后小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)單核樣細(xì)胞大量浸潤、神經(jīng)元變性壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，同時腦內(nèi)血管周炎性細(xì)胞滲出明顯(圖1B)，部分區(qū)域可形成明顯的管套現(xiàn)象。

IHC結(jié)果顯示：對照組小鼠腦組織切片背景清晰(圖1C)，JEV抗原的陽性信號呈棕黃色，主要定位在神經(jīng)元的胞質(zhì)。感染組小鼠腦組織的不同區(qū)域內(nèi)均可見大量的抗原陽性的細(xì)胞(圖1D)。

A.對照組小鼠腦組織，HE；B.JEV組小鼠腦組織血管周淋巴細(xì)胞浸潤，HE;C.對照組小鼠腦組織，IHC；D.JEV組小鼠腦組織(棕黃色指示細(xì)胞質(zhì)中的JEV抗原)，IHC

2.2 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量情況使用Illumina HiSeqTM平臺一共測了6個樣本，下機后對經(jīng)過初步過濾得到的Clean Reads進(jìn)行進(jìn)一步更嚴(yán)格的過濾，得到High Quality Clean Reads，比對到物種的參考基因組上，Clean Reads Q30(%)都在95%以上，滿足Q30標(biāo)準(zhǔn)；不確定堿基(N)比例均小于0.01%(表2)；從測序結(jié)果分析可以看出數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況匯總表

2.3 差異基因的篩選以FDR<0.01且|log2FC|>1，作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選對照組(CK組)與感染組(T1組)之間的差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因有1 940 個，其中有1 813個基因上調(diào)表達(dá)，127個基因下調(diào)表達(dá)(圖2)，大部分都與炎癥、免疫、防御反應(yīng)相關(guān)。對T1組參與免疫系統(tǒng)過程的相關(guān)差異基因進(jìn)行功能注釋見表3。

表3 免疫相關(guān)差異基因

圖2 差異表達(dá)基因數(shù)量統(tǒng)計表

2.4 差異基因的GO分析將T1篩選到的差異基因進(jìn)行GO聚類功能分析，總共涉及41種生物功能(圖3)。T1組生物學(xué)過程中涉及到細(xì)胞過程、單一生物過程、對刺激的反應(yīng)注釋量較多。涉及免疫系統(tǒng)過程的有651個差異基因，其中637個上調(diào)表達(dá)，14個下調(diào)表達(dá)。并且免疫系統(tǒng)過程是最顯著富集的GO Term(圖4)。在細(xì)胞組分中細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器注釋量較多；在分子功能中結(jié)合、催化活性注釋量較多。

圖3 差異基因GO注釋

圖4 BP中顯著性柱狀圖

2.5 差異基因的KEGG分析T1組共篩選到820個差異基因，富集到KEGG數(shù)據(jù)庫中，被注釋到具體的代謝通路268條。篩選出差異基因顯著性富集最多的前幾條代謝通路(圖5)，分別是細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用(Ko04060)、單純皰疹感染(Ko05168)、TNF信號通路(Ko04668)、NF-κB信號通路(Ko04064)、破骨細(xì)胞分化(Ko04380)。Pathway數(shù)目統(tǒng)計圖可以展示基因在KEGG Pathway中的基因數(shù)量，參與到免疫系統(tǒng)這個通路的差異基因有302個，是參與基因數(shù)量最多的(圖6)。

圖5 差異基因KEGG Pathway富集氣泡圖

圖6 Pathway數(shù)量統(tǒng)計圖

2.6 熒光定量RT-PCR驗證qPCR驗證結(jié)果顯示：Trim25、Hes5、P2ry12、Bpifa1、Cd4、TNF-α、SOCS1和SOCS3這8個基因的差異倍數(shù)與RNA-Seq結(jié)果表達(dá)趨勢基本一致(圖7)。

差異基因

3 討論

目前對大部分黃病毒致病機理的研究都建立了小鼠疾病模型。本試驗接毒后5～6 d的發(fā)病小鼠呈現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，部分小鼠出現(xiàn)立毛、弓背及運動功能障礙的表型癥狀。JEV感染小鼠后5～10 d，張金花等[9]病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大腦灰質(zhì)神經(jīng)元變形壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生及血管周圍炎性細(xì)胞聚集等顯著的炎性反應(yīng)。這與本研究組織病理學(xué)結(jié)果一致。結(jié)合大部分神經(jīng)元細(xì)胞JEV抗原陽性反應(yīng)，證明成功建立了小鼠的乙腦模型。

本試驗對JEV感染小鼠腦組織進(jìn)行高通量測序分析，共篩選到1 913個差異表達(dá)基因，大都與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)。GO功能富集分析中，免疫系統(tǒng)過程是最顯著富集的GO Term。JEV感染人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組也證實了許多與免疫有關(guān)的基因發(fā)生變化，差異基因主要涉及抗微生物反應(yīng)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞功能和維持等[10]。JEV感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞差異基因轉(zhuǎn)錄本的GO term分析發(fā)現(xiàn)2個主要功能的mRNA顯著富集：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核信號和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊反應(yīng)。并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工是最顯著富集的生物學(xué)通路[8]。前幾個顯著富集功能不同可能由于本研究中使用的小鼠和人源細(xì)胞之間的物種差異導(dǎo)致。

在KEGG富集分析中，參與到免疫系統(tǒng)的差異基因數(shù)目最多，富集的通路直接或間接都與抗病毒反應(yīng)有關(guān)，分別是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路和TNF信號通路。JAKs激活后磷酸化受體及胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子STAT及STAT蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，激活一系列細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的相互作用網(wǎng)絡(luò)的一部分包含組成免疫信號通路的部分，比如STAT、JNK和NF-κB。本研究中JEV感染導(dǎo)致小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白PERK、ATF4、CHOP的表達(dá)增加，WANG等[12]研究表明體內(nèi)和體外JEV感染可以通過二聚化激活PERK，并通過PERK-ATF4-CHOP途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CARR等[8]研究發(fā)現(xiàn)JEV感染后抗氧化劑Sestrin 2上調(diào)，并且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑轉(zhuǎn)錄本顯著上調(diào)。這與以上的研究結(jié)果一致。表明JEV在體內(nèi)與體外神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，刺激機體發(fā)出趨化信號，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而引起機體基因變化，整個過程是一個多基因參與表達(dá)且調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。同時，視黃酸誘導(dǎo)型基因1樣受體(RIG-1)、Toll樣受體3(TLR3)等模式識別受體可以識別病毒成分，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活A(yù)P-1和NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)各種ISGs的表達(dá)，防止病毒入侵[13]。這與JE的神經(jīng)病理學(xué)一致，其特征是嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥和以巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤[14]。

本研究中SOCS1和SOCS3轉(zhuǎn)錄本均顯著上調(diào)，并且共同在JAK-STAT信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。KUNDU等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著感染時間延長，JEV會上調(diào)細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制劑SOCS1和SOCS3的表達(dá)，改變JAK-STAT信號傳導(dǎo)級聯(lián)，抑制炎性細(xì)胞趨化因子的釋放，從而破壞宿主的先天性免疫反應(yīng)，有助于病毒的復(fù)制。另外YE等[16]證明JEV NS5蛋白通過與核轉(zhuǎn)運蛋白KPNA2、KPNA3和KPNA4相互作用，抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和NF-κB的表達(dá)。JEV感染也誘導(dǎo)RIPK3的表達(dá)，抑制IFI44L等ISGs的表達(dá)[7]，這表明JEV會通過某種機制阻止細(xì)胞信號傳導(dǎo)，抑制I型干擾素(IFN)反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)，逃避宿主先天免疫反應(yīng)。

在JEV感染過程中，宿主的先天性免疫應(yīng)答對于限制病毒復(fù)制和清除宿主體內(nèi)的病毒是非常重要的。本研究中，采用RNA-Seq得到JEV感染小鼠后腦組織的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)，系統(tǒng)性分析了JEV感染機體后免疫相關(guān)基因參與的代謝途徑與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為研究機體的抗病毒反應(yīng)提供了理論依據(jù)。