犬弓形蟲抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

柳方遠(yuǎn)，印春生，李雙星，單 虎，才學(xué)鵬，劉業(yè)兵*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種人畜共患原蟲，在世界范圍廣泛分布，全球約有1/3的人口感染弓形蟲[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，弓形蟲全球血清陽性率平均為25%～50%[2]。弓形蟲可專性寄生于人和動(dòng)物的有核細(xì)胞引起發(fā)病，孕婦感染弓形蟲可以引起早產(chǎn)、流產(chǎn)、胎兒畸形[3]；免疫力正常的人群多為隱性感染，免疫功能低下的患者可能出現(xiàn)淋巴結(jié)病或眼部弓形蟲病[4]，隱性感染個(gè)體再次感染，重新激活可導(dǎo)致致命的弓形蟲腦炎、心肌炎和肺炎[5]；弓形蟲感染同時(shí)也是艾滋病患者的死亡原因之一[6]。弓形蟲的中間宿主有200多種動(dòng)物，包括哺乳類、鳥類、魚類、爬行類和人等[7]，為典型的多宿主寄生蟲，貓科動(dòng)物是其惟一的終末宿主[8]。犬不僅是弓形蟲的中間宿主，也是該病最重要的傳染源之一。目前，我國犬類的弓形蟲感染較為普遍，感染率為3.94%～46.67%，在北方某些地區(qū)尤為嚴(yán)重[9]。隨著家養(yǎng)犬的數(shù)量不斷增多，人類與患病犬親密接觸，導(dǎo)致人感染弓形蟲的比率逐年上升，對(duì)人和動(dòng)物的健康造成極大的潛在威脅[10]。所以，對(duì)犬弓形蟲病進(jìn)行有效的診斷和監(jiān)測(cè)，降低人感染弓形蟲的幾率具有重大意義。

目前，檢測(cè)弓形蟲感染的方法，包括分子生物學(xué)診斷和血清學(xué)診斷。常規(guī)的PCR方法可用于在感染的急性期進(jìn)行檢測(cè)，但由于血液中無法獲得弓形蟲DNA，因此在慢性病例中無法檢測(cè)到感染[11]。血清學(xué)診斷為弓形蟲病最常用的診斷方法，其中ELISA檢測(cè)方法與其他血清學(xué)方法診斷弓形蟲病相比，具有可重復(fù)、易自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)，還可用于定性和定量檢測(cè)[12]，因此受到廣泛的關(guān)注。剛地弓形蟲18 kDa親環(huán)蛋白(Toxoplasmagondiicyclophilin ,TgCyP)是弓形蟲速殖子的重要成分，在弓形蟲的繁殖和緩殖子轉(zhuǎn)變過程中起重要作用[13]。目前，還未見該蛋白作為診斷抗原建立檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)剛地弓形蟲TgCyP基因進(jìn)行原核表達(dá)，并以純化的重組TgCyP為包被抗原，建立弓形蟲抗體間接ELISA檢測(cè)方法，為犬弓形蟲病的臨床診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料弓形蟲Chinese Ⅰ蟲株、Vero細(xì)胞、pET-32a原核表達(dá)載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞均購自Solarbio公司。犬弓形蟲標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清樣品由吉林農(nóng)科院曹莉莉惠贈(zèng)，犬血清臨床檢測(cè)樣品來自南京，狂犬病病毒(RABV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬腺病毒(CAV)等陽性血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑Ex Taq DNA聚合酶、總RNA提取試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ、T4DNA 連接酶購自NEB公司，HRP標(biāo)記的山羊抗犬二抗購自Invitrogen公司，DNA Marker和蛋白Marker購自大連寶生物公司，膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司，His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Beyotime公司。

1.3 目的基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中的TgCyP基因序列(XM_002369910.2)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物公司合成，設(shè)計(jì)的引物序列如表1。

表1 擴(kuò)增TgCyP基因引物序列

1.3.2弓形蟲RNA的提取及基因的擴(kuò)增 將弓形蟲接種到Vero細(xì)胞中培養(yǎng)，待蟲體溢出后收集純化弓形蟲，利用總RNA提取試劑盒對(duì)弓形蟲進(jìn)行RNA提取。利用PrimeScriptTMRT Master Mix獲得cDNA，以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目的基因，目的基因大小為1 035 bp。擴(kuò)增條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 2 min；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，利用膠回收試劑盒回收。

1.3.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將膠回收的目的基因與pET-32a表達(dá)載體同時(shí)用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳后切膠回收目的基因和pET-32a載體，利用T4DNA酶進(jìn)行連接，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐霉素的固體LB培養(yǎng)皿培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)增后提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物公司測(cè)序，并將測(cè)序鑒定正確的質(zhì)粒命名為pET-32a-C18。

1.3.4TgCyP的表達(dá)及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-32a-C18轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min搖菌4～6 h，培養(yǎng)至D600 nm為0.6時(shí)加入IPTG繼續(xù)培養(yǎng)8 h，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。離心收集菌體，用PBS重懸菌體進(jìn)行超聲裂解，裂解后10 000 r/min 離心5 min，分別收集上清和包涵體，包涵體用PBS重懸。SDS-PAGE電泳分析鑒定。

1.3.5TgCyP的純化和Western blot鑒定 將大量誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白按Beyotime His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒的純化程序?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行純化，得到純化后的TgCyP，測(cè)定濃度。SDS-PAGE后，將重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂乳37℃封閉1 h；洗膜后，加入1∶4 000稀釋的抗His標(biāo)簽蛋白的鼠單克隆抗體，室溫?fù)u床孵育2 h；洗膜后再加入1∶5 000 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫?fù)u床孵育1 h；洗膜后曝光，觀察結(jié)果。

1.4 弓形蟲間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.4.1最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法，用CBS(0.05 mol/L，pH 9.6)將TgCyP 按照4.000，2.000，1.000，0.500，0.250，0.125 mg/L 的質(zhì)量濃度做橫向兩倍倍比稀釋，100 μL/孔，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜，PBST洗滌3次。用5%的脫脂乳封閉2 h，200 μL/孔，PBST洗滌3次。將1份陽性血清和陰性血清按1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600進(jìn)行縱向梯度稀釋，37℃作用1 h，PBST洗滌3次。然后加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗犬二抗，每孔100 μL，37℃ 1 h，PBST洗滌3次。最后加入顯色液和終止液，測(cè)量D450 nm值，計(jì)算P/N。判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)D值接近1.0，P/N>2.1 時(shí)，對(duì)應(yīng)的條件即為抗原最佳包被質(zhì)量濃度和最適血清稀釋度。

1.4.2反應(yīng)條件的優(yōu)化 在上述基礎(chǔ)上對(duì)包被條件(4℃過夜、常溫過夜、37℃ 3 h)，封閉液(5%BSA、5%脫脂乳)和封閉時(shí)間(30，60，90 min)，待檢血清作用時(shí)間(30，60，90 min)，二抗稀釋倍數(shù)(1∶2 000，1∶4 000，1∶6 000，1∶8 000，1∶10 000，1∶12 000)和作用時(shí)間(30，60，90 min)進(jìn)行優(yōu)化。測(cè)量D450 nm的值，當(dāng)P/N最大時(shí)，所對(duì)應(yīng)的條件即為最佳作用條件。

1.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 分別做批間重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。選擇同一批次包被的3塊酶標(biāo)板和不同批次包被的3塊酶標(biāo)板，對(duì)3份陽性血清和3份陰性血清按照已經(jīng)優(yōu)化好的條件進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。若變異系數(shù)<10%則重復(fù)性好。

1.4.5特異性試驗(yàn) 利用已優(yōu)化的間接ELISA方法分別檢測(cè)CPIV、RABV、CDV、CPV和CAV 陽性血清，設(shè)置弓形蟲陽性和陰性對(duì)照血清，鑒定已建立的間接ELISA方法與犬其他病毒陽性血清是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4.6敏感性試驗(yàn) 將5份弓形蟲陽性血清各作1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800稀釋，并設(shè)陽性、陰性、空白對(duì)照，然后用已建好的方法進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，根據(jù)確立的臨界值判斷該方法能檢測(cè)出的犬弓形蟲陽性血清的最小值，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.4.7臨床樣本檢測(cè)與符合率試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法與改良凝集試驗(yàn)(MAT)[14]，對(duì)采自南京地區(qū)的226份犬的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算陽性率，比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 TgCyP基因的擴(kuò)增以cDNA為模版，T-C18-F和T-C18-R為上、下游引物，擴(kuò)增出TgCyP基因片段，如圖1所示，目的基因大小為1 035 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

M.DL2000 DNA Marker;1.TgCyP基因RT-PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-C18的雙酶切鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-C18經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ 雙酶切得到約5 870與1 035 bp 2條片段，如圖2所示，與預(yù)期大小一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL10000 DNA Marker;1.pET-32a-C18雙酶切產(chǎn)物;2.未經(jīng)酶切的質(zhì)粒

2.3 重組TgCyP蛋白的表達(dá)鑒定及Western blot分析將表達(dá)的重組TgCyP進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果如圖3所示，在誘導(dǎo)菌的上清中出現(xiàn)明顯的目的條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小為18 kDa，與預(yù)期相符，說明該目的蛋白在上清中大量表達(dá)，在包涵體中不表達(dá)。同時(shí)，為驗(yàn)證TgCyP蛋白的免疫反應(yīng)性，對(duì)蛋白純化后進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果如圖4顯示，純化后的蛋白無明顯雜帶，能與鼠抗His標(biāo)簽一抗進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)，在18 kDa處有特異性條帶。

M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker;1.重組蛋白上清;2.重組蛋白包涵體

A.SDS-PAGE(M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker,1.純化后的重組TgCyP蛋白)；B.Western blot(M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker,2.重組蛋白反應(yīng)條帶)

2.4 間接ELISA條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度的確定 采用方陣滴定法，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。取P≥1.0且P/N>2.1，P接近1.0對(duì)應(yīng)的D450 nm值，即為最佳抗原包被質(zhì)量濃度和最適血清稀釋度。檢測(cè)結(jié)果如表2所示，最佳抗原包被質(zhì)量濃度為1 mg/L，最適待檢血清稀釋度為1∶200。

表2 最佳抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度的確定

2.4.2反應(yīng)條件的優(yōu)化 在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以1 mg/L包被TgCyP，在1∶200血清稀釋度下，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)P/N值的大小確定了最佳包被時(shí)間為4℃過夜；最適封閉條件為5%脫脂乳封閉2 h；最佳底物作用時(shí)間為60 min；酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶4 000，二抗作用時(shí)間為60 min。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)(批間試驗(yàn))

表4 重復(fù)性試驗(yàn)(批內(nèi)試驗(yàn))

2.4.5特異性試驗(yàn) 利用已優(yōu)化的間接ELISA方法分別檢測(cè)CPIV、RABA、CDV、CPV和CAV 陽性血清。結(jié)果如表5顯示，用該檢測(cè)方法檢測(cè)犬弓形蟲特異抗體時(shí)，不與犬其他病毒陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好。

表5 特異性試驗(yàn)

2.4.6敏感性試驗(yàn) 為評(píng)估本研究方法的敏感性,將5份弓形蟲陽性血清作1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800稀釋進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表6顯示，陽性血清在1∶6 400 時(shí)的D450 nm均大于臨界值0.298，表明該檢測(cè)方法敏感性較高。

表6 敏感性試驗(yàn)

2.4.7臨床樣本檢測(cè) 應(yīng)用本研究建立的方法，對(duì)采自南京地區(qū)的226份犬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該批犬血清中弓形蟲抗體陽性率為24.34%(55/226)。將該結(jié)果與改良凝集試驗(yàn)MAT檢測(cè)結(jié)果比較，兩者的符合率為94.70%(67/226)，見表7。

表7 MAT和ELISA檢測(cè)結(jié)果對(duì)比 份

3 討論

弓形蟲多為隱性感染，沒有明顯的臨床癥狀，感染率高，危害嚴(yán)重，臨床診斷相對(duì)困難，至今尚無有效的防治藥物[15]。目前，針對(duì)犬弓形蟲病尚無十分完善的快速診斷方法，標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)化試劑盒也較少。間接ELISA方法能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣本，且靈敏、特異，能滿足臨床診斷的需要[16]。在過去的研究中，許多重組抗原，包括棒狀體蛋白R(shí)OP1、ROP2、ROP18、致密顆粒蛋白GRA3、GRA6、GRA7和GRA15[17]，表面抗原SAG1和SAG2，微線體蛋白MIC2、MIC3、MIC4和MIC5，以及基質(zhì)蛋白MAG1等已在大腸桿菌或酵母中表達(dá)，并通過ELISA評(píng)估了其在弓形蟲診斷方面的價(jià)值[18]。而弓形蟲分泌的TgCyP作為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信息傳遞介質(zhì)[19]，還未見有相關(guān)研究利用該蛋白作為診斷抗原建立檢測(cè)方法。

因此，在本研究中，我們重組表達(dá)了TgCyP，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白可溶性好，表達(dá)量高，易提純，是建立診斷方法的優(yōu)秀抗原。之后利用構(gòu)建好的重組TgCyP作為包被抗原，優(yōu)化各項(xiàng)反應(yīng)條件，建立了一種間接ELISA檢測(cè)方法。通過一系列試驗(yàn)，確定抗原最佳包被質(zhì)量濃度為1 mg/L，4℃包被過夜，5%脫脂乳封閉2 h，血清最適條件為1∶200稀釋，二抗最適條件為1∶4 000稀釋。建立的間接ELISA方法重復(fù)性良好，不與CPIV、CRV、CDV、CPV等犬其他血清發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性可達(dá)1∶6 400，試驗(yàn)證明，該方法特異性較好，敏感穩(wěn)定。

對(duì)226份犬的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，間接ELISA方法共檢測(cè)出55份弓形蟲抗體陽性樣品和171份陰性樣品，這55份陽性樣品均被MAT檢測(cè)為陽性，在171份血清陰性樣品中有12份MAT檢測(cè)為陽性，兩者的符合率為94.7%。建立的間接ELISA檢測(cè)方法與金標(biāo)準(zhǔn)MAT符合率較高，差值較小，后期會(huì)進(jìn)一步的完善。MAT試驗(yàn)中利用福爾馬林固定抗原，被檢血清用2-巰基乙醇處理，可去除非特異性抗體的干擾，但MAT反應(yīng)需要大量的弓形蟲速殖子，且反應(yīng)時(shí)間長，不適合大批樣本的檢測(cè)。而本研究建立的間接ELISA方法，敏感性和特異性高，重復(fù)性強(qiáng)，操作簡便，可快速檢測(cè)大量樣本。綜上所述，本方法適合犬弓形蟲的抗體檢測(cè)，為弓形蟲的流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)試劑盒的生產(chǎn)提供了技術(shù)參考。