血根堿對無乳鏈球菌抗菌活性及作用機(jī)制

宋 軍，呂觀新，王晗晟，劉 夢，王建發(fā)，孫東波，武 瑞

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院，黑龍江省牛病防制重點實驗室，黑龍江 大慶 163319)

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是引起傳染性奶牛乳腺炎主要致病菌之一[1]。近年來關(guān)于無乳鏈球菌引起奶牛乳腺炎的報道逐年增多，在某些地區(qū)無乳鏈球菌的檢出率高達(dá)70%[2]，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]，嚴(yán)重影響了奶牛養(yǎng)殖業(yè)和乳品行業(yè)。同時，無乳鏈球菌也是重要的人畜共患性致病菌，可以感染人類和其他動物，具有重要的公共衛(wèi)生意義[4-5]。由于臨床抗菌藥物不合理的使用，導(dǎo)致無乳鏈球菌致病性、耐藥性逐漸增強(qiáng)，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康[6-7]。因此，有效防控?zé)o乳鏈球菌對于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展非常重要。

與傳統(tǒng)的抗生素相比，中草藥來源廣泛、活性高、安全性好，是一種綠色、新型、高效的抗生素替代品之一，現(xiàn)已成為研究的熱點，具有廣泛的應(yīng)用前景。血根堿(C20H15O5N)是一種苯菲喹啉類生物堿，是博落回提取物的重要有效成分，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤[8]、抗菌[9]、抗炎[10]、抗腫瘤[11]以及抗血管生成[12]等。

前期研究表明，血根堿對魚源無乳鏈球菌具有較好的抑菌效果，在抑制細(xì)菌生長的同時還能夠抑制無乳鏈球菌形成生物被膜結(jié)構(gòu)的形成[13]。為此，本研究主要評價血根堿對牛源無乳鏈球菌的抗菌活性，探究血根堿對無乳鏈球菌的抗菌機(jī)制，為臨床無乳鏈球菌性奶牛乳腺炎的防治提供了新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 菌株及藥品來源無乳鏈球菌ATCC13813購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；牛源無乳鏈球菌分離株由黑龍江省牛病防制重點實驗室保存；血根堿(99%)購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑和儀器腦心浸出液肉湯(BHI)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；低溫冷離心機(jī)(德國艾本德股份公司)；酶標(biāo)儀Elx800(美國BioTek公司)；流式細(xì)胞儀CytoFLEX(美國貝克曼庫爾特)；Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.3 血根堿對無乳鏈球菌抗菌活性

1.3.1最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC) 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定參考WIEGAND等[14]的方法略作修改。血根堿以2%DMSO為溶劑，配置成5 g/L備用。用BHI培養(yǎng)基對血根堿進(jìn)行倍比稀釋，每孔100 μL加至96孔微量培養(yǎng)板中，同時每孔加入100 μL濃度約為105CFU/mL對數(shù)生長期無乳鏈球菌菌液，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組3個重復(fù)。設(shè)立DMSO對照組、空白對照(BHI培養(yǎng)基)和陰性(PBS)對照組。以沒有肉眼可見的細(xì)菌生長的最小質(zhì)量濃度為血根堿的MIC。最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)是指將MIC以上各孔培養(yǎng)物，分別吸取100 μL接種在BHI瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計數(shù)，其菌落數(shù)少于5個的血根堿濃度。

1.3.2血根堿對無乳鏈球菌生長的影響 采用DIAO等[15]的方法，稍作修改。將無乳鏈球菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1%接種不同濃度血根堿(0.25×MIC、0.50×MIC、1.00×MIC與2.00×MIC)至無菌BHI培養(yǎng)基中，置于37℃，160 r/min 搖床培養(yǎng)8 h，每間隔30 min取樣測600 nm處吸光度，繪制時間—抑菌曲線。以不添加血根堿的菌液作為對照組，每組做3次重復(fù)。

1.4 溶血活性參考PENG等[16]的方法做適當(dāng)修改。新鮮采集兔血在4℃下1 000×g離心5 min，得到rRBCs用阿氏液洗滌3次，稀釋10倍(pH 7.4)。然后，50 μL rRBC解決方案(最終濃度為5%)加入等量不同濃度的血根堿。在37℃孵育60 min后測定上清液在450 nm處的吸光度。rRBCs分別用0.1% Triton X-100和阿氏液處理后,設(shè)置為陰性對照和陽性對照。每個測試是一式3份，測試2次。溶血程度按下式計算：溶血率=[(樣品D450-陰性D450)/(陽性D450-陰性D450)]×100%。

1.5 血根堿對無乳鏈球菌細(xì)胞膜的影響

1.5.1血根堿對無乳鏈球菌D260和D280的影響 參考CHEN等[17]的方法測定血根堿對無乳鏈球菌紫外吸收物質(zhì)的影響。將血根堿加入待測菌株培養(yǎng)液中，使終濃度為1.00×MIC。置于37℃，150 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)，8 h內(nèi)每間隔1 h取樣4 000 r/min、4℃離心10 min，通過紫外分光光度計測定菌體上清液的D260和D280值，每組做重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.5.2血根堿對無乳鏈球菌存活率的影響 參考吳學(xué)友等[18]的方法，適當(dāng)調(diào)整試驗步驟。將對數(shù)期無乳鏈球菌(D600=0.5)用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)清洗和重懸。菌懸液(終濃度為108CFU/mL)與血根堿(終濃度1.00×MIC)等體積混合。在37℃條件下培養(yǎng)1 h后用PBS清洗、重懸。加入熒光染料碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，使其終質(zhì)量濃度均為5 mg/L，37℃條件下避光孵育10 min，用PBS清洗、重懸后，采用流式細(xì)胞儀對染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)分析。

1.5.3胞外乳酸脫氫酶(LDH)活性的測定 將無乳鏈球菌活化培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并接種至含終濃度1.00×MIC的血根堿液體培養(yǎng)基中，使含菌濃度為108CFU/mL，同時用PBS代替血根堿藥液作為對照組，37℃ 160 r/min 搖床培養(yǎng)。8 h內(nèi)每間隔1 h，各取1.0 mL，用0.22 μm孔徑的無菌濾器過濾，取濾液，按乳酸脫氫酶檢測試盒說明書測定LDH含量。

1.6 血根堿對無乳鏈球菌細(xì)胞形態(tài)的影響將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的無乳鏈球菌用PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)制備為108CFU/mL的菌懸液，加入血根堿(終濃度1.00×MIC)。37℃作用6 h后，4 000 r/min離心10 min，用PBS清洗3遍，菌體用2.5%戊二醛4℃條件下固定過夜。隨后，用乙醇(30%，50%，70%，85%，90%和100%)對樣品進(jìn)行連續(xù)梯度脫水，用叔丁醇代替乙醇脫水2次，干燥儀干燥樣品，噴金制樣，采用日立S-4800掃描電子顯微鏡觀察。

1.7 血根堿對無乳鏈球菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響前期菌體固定與掃描電鏡樣品制備方法一致，2.5%戊二醛固定后用PBS清洗菌體3遍，1%鋨酸溶液固定1 h，用PBS清洗菌體3遍，丙酮梯度脫水。環(huán)氧樹脂包埋過夜，50℃烘干48 h。1%乙酸雙氧鈾染色，切片制樣后采用JEM-2100 Plus透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 MIC和MBC通過測定血根堿對無乳鏈球菌ATCC13813及牛源分離株的抗菌活性，表明血根堿對無乳鏈球菌MIC為9 mg/L，MBC為36 mg/L。

2.2 血根堿對無乳鏈球菌的抑菌動力學(xué)曲線D600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的方法之一，可以考察血根堿對乳源病原菌無乳鏈球菌生長的抑制作用。向?qū)?shù)生長期菌液中加入不同濃度血根堿后，試驗組D600呈不同程度的抑制。加入血根堿(1.00×MIC和2.00×MIC)，8 h內(nèi)無乳鏈球菌完全被抑制，菌液澄清停止生長；血根堿在亞抑菌濃度(0.50×MIC)下細(xì)菌生長緩慢，但隨著作用時間延長，細(xì)菌生長速率超過被抑制速率，5 h左右開始逐漸增長。這表明適當(dāng)濃度的血根堿能明顯抑制無乳鏈球菌的生長。

2.3 溶血活性為了進(jìn)一步了解血根堿對哺乳動物細(xì)胞膜的毒性，檢測了不同濃度血根堿對兔血紅細(xì)胞的溶血活性。從圖2A中可以看出，低濃度血根堿對兔紅細(xì)胞沒有裂解活性。當(dāng)血根堿濃度達(dá)到4.00×MIC時，對紅細(xì)胞表現(xiàn)出了溶血活性(41.3%)。但從圖2B中能夠看出，血根堿濃度為4.00×MIC時，血根堿本身的顏色影響了450 nm吸光度的測定，導(dǎo)致溶血活性的增高。

A.450 nm吸光度測定；B.定性檢測溶血活性

2.4 血根堿對無乳鏈球菌D260和D280的影響如圖3A所示，隨著作用時間延長，血根堿處理組和對照組D260都增高，但血根堿處理組D260顯著高于對照組，說明核酸類物質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。血根堿處理組D280隨著時間延長不斷延長，前3 h增長較快，后趨于平穩(wěn)，同樣顯著高于對照組(圖3B)，說明蛋白質(zhì)類物質(zhì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。細(xì)胞外上清液中D260和D280的增加表明血根堿(1.00×MIC)能破壞細(xì)胞膜，使無乳鏈球菌細(xì)胞中的大分子物質(zhì)外流，進(jìn)而影響細(xì)胞生長代謝。

圖3 血根堿對無乳鏈球菌D260(A)和D280(B)的影響

2.5 血根堿對無乳鏈球菌存活率的影響從圖4A所示，沒被血根堿處理的對照細(xì)胞所處的區(qū)域為無PI熒光活性信號的區(qū)域，血根堿處理后的大部分細(xì)胞被熒光標(biāo)記，細(xì)胞所處的區(qū)域發(fā)生改變。血根堿(1.00×MIC)處理后，有74.12%的細(xì)胞被PI染成陽性細(xì)胞，呈紅色熒光(圖4B)。因此，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果說明血根堿能夠破壞細(xì)胞膜，誘導(dǎo)PI流入細(xì)胞內(nèi)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜損傷情況

2.6 胞外LDH活性的測定在細(xì)胞遭受損傷通透性改變的情況下，LDH會泄漏至胞外，通過檢測菌液中LDH活力的變化，也可反映細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷情況[19]。在培養(yǎng)期間，對照組胞外LDH活性變化不顯著，血根堿(1.00×MIC)處理組胞外LDH活性隨著時間延長而增加(圖5)。推測血根堿處理的無乳鏈球菌膜通透性變大，存在于細(xì)胞漿內(nèi)的LDH和核酸等生物大分子外流，細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)丟失，從而抑菌殺菌。這說明血根堿不僅能提高無乳鏈球菌細(xì)胞膜通透性，而且能破壞細(xì)胞膜的完整性。

圖5 血根堿對無乳鏈球菌菌液LDH活力的影響

2.7 血根堿對無乳鏈球菌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡直接的觀察無乳鏈球菌的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化[16,20-21]。由SEM觀察結(jié)果(圖6)顯示，未加血根堿空白對照組(圖6A)無乳鏈球菌細(xì)胞呈典型的鏈狀、形態(tài)飽滿圓潤、表面光滑。血根堿(9 mg/L)處理組(圖6B，C)大部分細(xì)胞呈黏連狀態(tài)，細(xì)胞表面塌陷、皺縮，甚至破裂。由TEM觀察結(jié)果(圖7)顯示，未經(jīng)血根堿處理的無乳鏈球菌細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整，內(nèi)容物致密，均勻分布，細(xì)胞形態(tài)完整。血根堿(9 mg/L)處理的細(xì)胞，菌體結(jié)構(gòu)疏松、變形，電子密度降低、胞內(nèi)透亮，細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物泄漏(圖7B，C)。這說明血根堿對無乳鏈球菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)均造成了破壞性影響。

A.空白對照組；B，C.9 mg/L血根堿；1.細(xì)菌細(xì)胞皺縮、鏈斷裂；2.細(xì)菌細(xì)胞皺縮；3.細(xì)菌細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放

A.空白對照組；B，C.9 mg/L血根堿；1.細(xì)菌細(xì)胞皺縮；2.細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物減少，質(zhì)壁分離；3.細(xì)菌細(xì)胞破裂，內(nèi)容物釋放

3 討論

本試驗測得血根堿對無乳鏈球菌MIC為9 mg/L，MBC為36 mg/L，與丁浩等[13]的試驗結(jié)果不完全一致，可能是因為無乳鏈球菌來源不同，細(xì)菌對藥物的耐受能力存在差異。為了評估藥物的安全性測定了血根堿對哺乳動物紅細(xì)胞的毒性，當(dāng)血根堿濃度達(dá)到4.00×MIC時，表現(xiàn)對紅細(xì)胞的溶血活性，這主要是血根堿本身的顏色會使450 nm吸光度增高，造成對紅細(xì)胞溶血活性增加的現(xiàn)象。從圖2中不難看出，當(dāng)血根堿為MBC時對無乳鏈球菌的抗菌作用是安全有效的。

目前，雖然已有文獻(xiàn)報道血根堿具有抗菌作用，但對其抗菌機(jī)制的研究較少[22]。抗菌藥物抑制細(xì)菌生長的機(jī)制較為復(fù)雜，包括抑制細(xì)胞壁的合成、直接破壞細(xì)胞膜、抑制核酸和蛋白質(zhì)的合成和抑制核酸代謝等[23]。圖1結(jié)果顯示，當(dāng)血根堿濃度為0.50×MIC時，5 h內(nèi)能夠明顯抑制無乳鏈球菌生長，之后隨著時間的推移無乳鏈球菌緩慢增長。說明血根堿可能誘導(dǎo)膜結(jié)合細(xì)胞壁自溶酶的釋放[24]，或者弱化了細(xì)胞壁對維持細(xì)胞形態(tài)的作用[25]，導(dǎo)致部分菌體細(xì)胞裂解。

圖1 不同濃度血根堿對無乳鏈球菌生長的影響

細(xì)胞膜作為細(xì)菌自我保護(hù)的第一道屏障，在防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[26]，許多藥物、抗菌肽都是通過誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的變化來展開抗菌活性的[27]。因此，本試驗通過測定血根堿作用無乳鏈球菌后細(xì)菌上清液D260和D280來評價細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性并探討其抑菌作用機(jī)制[28-29]。結(jié)果顯示，與對照組相比試驗組D260和D280顯著升高，血根堿(1.00×MIC)能使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)外流，進(jìn)而影響細(xì)胞代謝。熒光染料PI流入胞內(nèi)能夠說明藥物對細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的影響[30]。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明有74.12%的細(xì)胞被PI染成陽性細(xì)胞，說明血根堿破壞了無乳鏈球菌細(xì)胞膜完整性。進(jìn)一步檢測胞外乳酸脫氫酶的活性，血根堿處理后胞外LDH活性隨著時間延長而增加，表明血根堿不僅能提高無乳鏈球菌細(xì)胞膜通透性，而且能破壞細(xì)胞膜的完整性，與胞外紫外吸收變化和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果相對應(yīng)。結(jié)合掃描電鏡和透射電鏡觀察，血根堿處理后，細(xì)菌細(xì)胞呈黏連狀態(tài)，細(xì)胞表面塌陷、內(nèi)部電子密度降低、胞內(nèi)透亮，細(xì)胞壁破裂、內(nèi)容物外流，說明血根堿對無乳鏈球菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及外部形態(tài)均造成破壞性影響，與上述結(jié)果相吻合。

上述結(jié)果全方位證明了血根堿對無乳鏈球菌細(xì)胞的損傷。血根堿的抑菌機(jī)制可能與其理化特性相關(guān)，與無乳鏈球菌表面某些物質(zhì)作用后引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、破壞，核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)釋放，細(xì)胞通透性增加，從而影響細(xì)胞功能與形態(tài)，導(dǎo)致無乳鏈球菌死亡。