腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在李斯特菌感染山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)

李國生，彭瑞妮，鄭文亞，劉 犇

(1.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000; 2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西 宜春 336000; 3.江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江西 宜春 336000)

單核增生李斯特菌(Listeriamonocytogene,LM)是一種好氧或兼性厭氧的革蘭陽性菌[1]，能適應(yīng)各種極端環(huán)境，即使在長時(shí)間的干旱、pH值4.7～9.6、溫度0～45℃條件下也能生存與繁殖[2]。此外，它還能耐受高濃度的鹽，即便在10%～20%的鹽濃度下依然可以生存，因此在環(huán)境中廣泛存在[3]。李斯特菌寄生于土壤和無癥狀動(dòng)物的腸道內(nèi)，土壤和糞便的污染導(dǎo)致細(xì)菌易于出現(xiàn)在飼料中，尤其是青貯飼料，因此牛、羊等反芻動(dòng)物具有較高的患病率[2]。此外，李斯特菌也是人類李斯特菌病的病原體，人類食用受污染的食物而發(fā)生感染[4-5]。李斯特菌的感染具有趨向性，它常以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胎盤系統(tǒng)為靶器官，侵入神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，在人類主要表現(xiàn)為腦膜炎和腦膜腦炎，在反芻動(dòng)物主要表現(xiàn)為菱形腦炎[5-6]；當(dāng)其侵入胎盤系統(tǒng)時(shí)，則會(huì)引起圍產(chǎn)期胎兒流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒的全身性感染[7]。此外，李斯特菌還可能引起菌血癥、敗血癥以及發(fā)熱性胃腸炎等病癥[8]。李斯特菌對(duì)畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生影響巨大，已成為影響全球公共衛(wèi)生安全的一個(gè)重要問題[2,9]。李斯特菌菌體蛋白抗體是由標(biāo)準(zhǔn)李斯特菌1株和4a株中分離得到的抗原所制備得來，此抗體免疫原是李斯特菌全細(xì)胞蛋白[10]。通過李斯特菌菌體蛋白的免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果即可得知李斯特菌侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)后的分布情況。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)素[11]，它能夠促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長、遷移和分化成熟，維持神經(jīng)元的正常功能，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷[11-12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)可以防止視網(wǎng)膜損傷后BDNF水平的下降，從而通過阻止補(bǔ)體介導(dǎo)的突觸消除來保護(hù)神經(jīng)元，并維持其功能[13]，而BDNF-TrkB通路可介導(dǎo)內(nèi)源性氣體介質(zhì)硫化氫對(duì)甲醛誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激和凋亡的神經(jīng)保護(hù)[14]。國內(nèi)外對(duì)李斯特菌及BDNF的研究已較為深入，但對(duì)于李斯特菌侵入山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定位以及侵入后對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF表達(dá)的影響研究還未見報(bào)道，本研究通過對(duì)這兩方面的探討，以期對(duì)李斯特菌的進(jìn)一步深入研究及臨床更好地防治提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料贛西某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)已確診感染李斯特菌發(fā)病山羊3頭(感染組)以及3頭未感染李斯特菌的正常山羊(對(duì)照組)，分別采集其大腦、中腦、小腦、腦橋和脊髓，用PBS洗后部分放入4%多聚甲醛固定，用于姬姆薩染色和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)，部分迅速放入液氮，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)。

1.2 主要試劑李斯特菌菌體蛋白抗體(bs-4581R)購自Bioss公司，BDNF抗體(SC-546)購自Santa Cruz公司，兔SP試劑盒、DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(ab6721)購自Abcam公司，Mouse Anti-β-actin內(nèi)參蛋白(BM0627)和Western blot彩色預(yù)染蛋白Marker(AR1113)購自博士德生物公司，4×Protein Loading Buffer(AI11800A)購自TaKaRa公司，超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(GS0720)購自US EVERBRIGHT INC公司，姬姆色素(51811-82-6)購自北京夢(mèng)怡美生物科技有限公司。

1.3 姬姆薩染色將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蒸餾水洗2次，1 min/次。置于含姬姆薩工作液的染缸中染色18 h，蒸餾水微洗后以0.5%乙酸洗1 min，自來水稍微沖洗。用無水乙醇迅速脫水3次，5 s/次。二甲苯透明，封片后觀察拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)將石蠟切片置于烘片機(jī)上烘干，后脫蠟水化，置于蒸餾水和PBS中各浸泡5 min，隨即進(jìn)行抗原修復(fù)10 min，冷卻至室溫后用PBS洗滌3次，每次3 min，隨后按兔SP試劑盒說明書進(jìn)行阻斷和封閉。PBS洗滌后37℃孵育一抗(李斯特菌菌體蛋白抗體和BDNF抗體均按1∶400進(jìn)行稀釋，陰性對(duì)照以PBS替代)1 h，繼續(xù)按兔SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。然后進(jìn)行DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，返藍(lán)后脫水透明，封片后立即進(jìn)行觀察和拍照。DAB顯色部位呈黃色者為陽性，呈淺黃色者為弱陽性，否則為陰性。

1.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)取各腦組織研磨碾碎，加入裂解液裂解后用總蛋白提取試劑盒抽提制備蛋白提取液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，并使感染組和正常組的總蛋白濃度保持一致。制備好分離膠和濃縮膠，并按比例在蛋白提取液中加入4×Protein Loading Buffer制成蛋白上樣液，按順序上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳2.0 h，取凝膠孵PVDF膜濕轉(zhuǎn)1.5 h，TBST洗滌后封閉2.0 h，將膜裁剪成適當(dāng)大小后用TBST洗滌3次，10 min/次，4℃條件下放入一抗(BDNF按1∶500進(jìn)行稀釋)與內(nèi)參蛋白Mouse Anti-β-actin(1∶1 000稀釋)孵育18 h，TBST洗滌3次，10 min/次，孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG(按1∶10 000進(jìn)行稀釋)，內(nèi)參蛋白(按1∶10 000進(jìn)行稀釋)2 h，TBST洗滌3次，10 min/次。最后將PVDF膜按照HRP-ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明進(jìn)行成像，運(yùn)用AI600化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。

1.6 圖像與數(shù)據(jù)分析運(yùn)用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)采集的圖片進(jìn)行分析，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為測(cè)試值，并用SPSS 18.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.01時(shí)表示差異極顯著，P<0.05時(shí)表示差異顯著，P>0.05時(shí)表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 李斯特菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定位在感染組山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，李斯特菌主要分布于大腦錐體層錐體細(xì)胞、多形細(xì)胞層梭形細(xì)胞及內(nèi)、外顆粒層(圖1A)、小腦顆粒層顆粒細(xì)胞(圖1B)、中腦灰質(zhì)部膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及其周邊組織(圖1 C)、腦橋灰質(zhì)部中間神經(jīng)元和中性粒細(xì)胞等(圖1 D)，以及脊髓中央管室管膜上皮細(xì)胞(圖1E)。對(duì)照組則無李斯特菌分布(圖1F)。

A～E.分別為李斯特菌在感染組山羊大腦、小腦、中腦、腦橋和脊髓的分布情況；F.對(duì)照組山羊大腦姬姆薩染色情況；箭頭所指均為李斯特菌

2.2 李斯特菌菌體蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)定位在感染李斯特菌山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大腦、小腦、中腦及腦橋菌體蛋白表達(dá)較多，且主要在胞質(zhì)表達(dá)。其中大腦在內(nèi)錐體層的大、中型錐體細(xì)胞及多形細(xì)胞層的梭形細(xì)胞呈陽性表達(dá)，在外顆粒層及內(nèi)顆粒層呈弱陽性表達(dá)(圖2A)。小腦主要在顆粒層細(xì)胞外表達(dá)，浦肯野細(xì)胞層也有所表達(dá)，但表達(dá)很弱(圖2B)。中腦主要在灰質(zhì)部的膠質(zhì)細(xì)胞及白質(zhì)部的中間神經(jīng)元以及中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)(圖2C)。腦橋主要在中間神經(jīng)元、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，在軸突及神經(jīng)纖維網(wǎng)也有所表達(dá)(圖2D)。脊髓除脊髓中央管的室管膜細(xì)胞呈陽性表達(dá)外，其余部位均無表達(dá)(圖2E)。對(duì)照組山羊各腦組織中均未見李斯特菌菌體蛋白表達(dá)(圖2a～e)。

2.3 BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)定位BDNF在感染李斯特菌山羊大腦、小腦及中腦呈陽性表達(dá)，主要在胞質(zhì)中表達(dá)。其中大腦主要在外錐體層中、小型錐體細(xì)胞及星形細(xì)胞表達(dá)，內(nèi)顆粒層星形細(xì)胞，內(nèi)錐體層大、中型錐體細(xì)胞，多形細(xì)胞層的梭形細(xì)胞、小型錐形細(xì)胞，分子層及外顆粒層呈弱陽性表達(dá)或無表達(dá)(圖3A)。小腦主要在皮質(zhì)部表達(dá)，髓質(zhì)不表達(dá)，皮質(zhì)中以顆粒層表達(dá)更強(qiáng)，浦肯野細(xì)胞層及分子層次之(圖3B)。中腦主要在膠質(zhì)細(xì)胞、中間神經(jīng)元和淋巴細(xì)胞表達(dá)(圖3C)。腦橋也有陽性反應(yīng)，主要表達(dá)在中性粒細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，但相比小腦和中腦等表達(dá)更弱(圖3D)，脊髓則無表達(dá)(圖3E)。BDNF在對(duì)照組山羊大腦內(nèi)錐體層表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，但相比感染組表達(dá)很弱，外顆粒層及外錐體層呈弱陽性表達(dá)(圖3a)。在中腦中也呈弱陽性表達(dá)，但表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量比感染組更少(圖3c)。BDNF在對(duì)照組小腦(圖3b)、腦橋(圖3d)和脊髓(圖3e)中未見表達(dá)。

A～E.分別為感染組山羊大腦、小腦、中腦、腦橋和脊髓BDNF的表達(dá)情況；a～e.分別為對(duì)照組山羊大腦、小腦、中腦、腦橋和脊髓BDNF的表達(dá)情況。圖A、a為大腦多形細(xì)胞層，箭頭所指為梭形細(xì)胞；圖B箭頭所指為顆粒層顆粒細(xì)胞間陽性區(qū)域；圖C、c箭頭所指為膠質(zhì)細(xì)胞；圖D箭頭所指為中性粒細(xì)胞；箭頭所指均為陽性表達(dá)區(qū)域

2.4 BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的定量表達(dá)情況如圖4所示，與對(duì)照組相比，感染組山羊大腦和腦橋BDNF表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，小腦、中腦和脊髓BDNF表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

A.BDNF蛋白在大腦、小腦、中腦、腦橋和脊髓的Western blot檢測(cè)結(jié)果；B為使用Image J軟件時(shí)圖A的Western blot定量結(jié)果進(jìn)行分析。同一組織2個(gè)組間標(biāo)記不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

3 討論

李斯特菌是一種食源性細(xì)菌，畜禽食用受污染的飼料而患李斯特菌病，其典型侵入途徑是胃腸道。作為一種胞內(nèi)寄生菌，李斯特菌進(jìn)入腸腔后，不會(huì)直接破壞腸壁的完整性，而是先進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，借此逃避局部免疫，進(jìn)而通過門脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟和脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)其被釋放出來后，即可能引起菌血癥[1]。李斯特菌通過血行途徑到達(dá)中樞，破壞血腦屏障，侵入各腦組織，從而引起單側(cè)眼失明和轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀[6,15-16]。本試驗(yàn)姬姆薩染色及李斯特菌菌體蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，李斯特菌主要侵入部位為山羊大腦、小腦、中腦及腦橋，而在脊髓中僅脊髓中央管室管膜上皮細(xì)胞有所分布，這與其他學(xué)者免疫組織化學(xué)菌體蛋白定位研究結(jié)果相似，包括在小腦顆粒層細(xì)胞外的表達(dá)，中腦和腦橋中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腦橋軸突、神經(jīng)纖維網(wǎng)的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)腦組織病變始終可見于中腦吻側(cè)，包括間腦和端腦，且從低位腦干到大腦、小腦以及脊髓的尾側(cè)，其嚴(yán)重程度逐漸降低[17]，這也提示李斯特菌可能通過口腔和腸道的黏膜或通過受感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞間傳播侵入顱神經(jīng)或神經(jīng)末梢，并通過軸突遷移到腦干進(jìn)一步擴(kuò)散到大腦其他區(qū)域[17-18]。另有研究表明所有患有李斯特菌腦炎的動(dòng)物腦干區(qū)均受損傷，且大部分急性和亞急性菱形腦炎可在三叉神經(jīng)節(jié)和顱神經(jīng)中檢測(cè)到李斯特菌，并發(fā)現(xiàn)李斯特菌對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的侵入主要通過軸突擴(kuò)散[19]。

李斯特菌病雖然發(fā)病率低，但致死率高，可達(dá)20%～30%，目前雖有較好的治療方法，但仍需重視，控制發(fā)病率[8]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)BDNF可能對(duì)李斯特菌的侵入有一定的防御抵抗作用。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一員，而神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類獨(dú)特的多肽生長因子，它存在于所有脊椎動(dòng)物中，還包括神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)因子4(NT-4)，這些因子被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)分子，能夠影響神經(jīng)元的增殖、分化和存活，對(duì)人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高級(jí)功能如學(xué)習(xí)與記憶等有巨大影響[20]。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的主要成員，在皮層、海馬、邊緣結(jié)構(gòu)、小腦和嗅球等結(jié)構(gòu)中均有高表達(dá)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，并且已經(jīng)證實(shí)BDNF是突觸細(xì)化、可塑性和神經(jīng)保護(hù)的關(guān)鍵因素[13,20-22]。還有研究表明BDNF表達(dá)水平的提高可顯著增加軸突分支和突觸數(shù)量，并以此來影響神經(jīng)回路的功能復(fù)雜性[23]。本試驗(yàn)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示在自然感染李斯特菌山羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF在大腦、小腦、中腦、腦橋以及脊髓中的表達(dá)均有所增加，表明BDNF可能在李斯特菌感染神經(jīng)系統(tǒng)后發(fā)揮一定的保護(hù)作用。關(guān)于BDNF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的維持和保護(hù)作用已有不少研究，BDNF能夠促進(jìn)大腦基底神經(jīng)節(jié)紋狀體神經(jīng)元的存活，促進(jìn)其成熟，維持細(xì)胞正常功能，從而成為亨廷頓舞蹈癥的潛在治療靶點(diǎn)[24-25]；BDNF還能促進(jìn)小腦顆粒細(xì)胞的存活，促進(jìn)其遷移，刺激軸突的生長[26]。此外，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可在孕酮作用下釋放成熟BDNF，促進(jìn)神經(jīng)元的突觸形成和存活[27]。在本研究中各腦組織則可能通過增加BDNF的表達(dá)來抵抗李斯特菌的侵入及修復(fù)其所帶來的損傷，但其具體保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。