插入BC株V蛋白的重組新城疫病毒(LaSota株)毒力鑒定及對先天性免疫的影響

于 桐，南福龍，王 政，于成東，孟 媛，李亭玉，蔡錦順，魯會軍，金寧一

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133002；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春130122；3.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的急性高度接觸性動物傳染病，自1926年發(fā)現(xiàn)以來，在全球有過4次大流行，給世界家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。NDV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒屬(Avulavirus)的有囊膜的單鏈負(fù)股、不分節(jié)段的RNA病毒[4]，具有多種基因型和唯一的血清型，血清型可再進(jìn)一步分為Ⅰ和Ⅱ類[2]。從1946年我國首次分離到NDV F48強(qiáng)毒株至今，我國流行的毒株已經(jīng)由Ⅸ型轉(zhuǎn)變?yōu)棰餍蚚5-6]，由于危害廣泛,其致病和免疫機(jī)理成為研究的重點[7]。

基因Ⅱ型中等毒力NDV Beaudette C(BC)株長度為15 186 nt，NDV的P基因可通過RNA編輯機(jī)制在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物484位點(UUUUUCCC)插入1或2個非模板G，從而編碼非結(jié)構(gòu)蛋白V和W[8]。NDV的V蛋白能夠拮抗宿主細(xì)胞IFN系統(tǒng)抑制IFN-β的生成，在病毒免疫逃避機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，但W蛋白功能目前尚不清楚[9]。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT)通路是重要的先天性免疫的信號通路，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，磷酸化 STAT1 是該信號傳導(dǎo)通路上的關(guān)鍵蛋白，而模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)是宿主細(xì)胞抵抗病毒感染的重要防線，黑色素瘤分化相關(guān)基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)是胞漿內(nèi)的核酸受體，能與病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相結(jié)合,特異性地識別雙鏈 RNA，通過自身級聯(lián)激活和招募結(jié)構(gòu)域，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，活化后的轉(zhuǎn)錄因子會進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn) IFN 的表達(dá)[10]，因此檢測 P-STAT1 和 MDA5 的表達(dá)水平對探討外源V蛋白對先天性免疫反應(yīng)的影響有重要意義。

本試驗為研究NDV中等毒力BC株V蛋白在感染過程中對毒力的提升和對先天性免疫及IFN拮抗作用的影響，測定了其雞胚平均死亡時間(mean death time,MDT)、腦內(nèi)致病指數(shù)(intracerebral pathogenicity index,ICPI)和靜脈內(nèi)致病指數(shù)(intravenous pathogenicity index,IVPI) 和重組病毒的毒力以及不同時間的感染效率，還檢測了上清IFN-β生成情況，病毒感染12，24 h后P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平，及對DF1和A549細(xì)胞先天性免疫分子轉(zhuǎn)錄水平的影響，為進(jìn)一步探索NDV V蛋白對先天性免疫及IFN拮抗機(jī)制的影響奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料ND重組病毒 rL-BC 株由軍事獸醫(yī)研究所分子病毒學(xué)與免疫學(xué)實驗室保存；重組NDV弱毒 LaSota 親本株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所重要人獸共患病與烈性外來病實驗室保存；9～11日齡SPF雞胚、1日齡的SPF雛雞、6周齡SPF雞均購于哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物管理中心。

1.2 病毒的毒力測定按照 OIE 標(biāo)準(zhǔn)公式測定MDT、ICPI和IVPI：稀釋重組病毒和親本毒并接種 SPF 雞胚，觀察雞胚的死亡情況并計算MDT；并在10只1日齡的SPF 雛雞體內(nèi)接種稀釋的重組病毒，計算 ICPI；之后靜脈接種10只6周齡SPF雞，觀察雞的發(fā)病死亡情況并計算IVPI。

1.3 病毒不同時間的感染效率測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細(xì)胞4，8，12 h后，通過間接免疫熒光反應(yīng)，檢測其不同時間的感染效率。

1.4 病毒感染后IFN-β生成量測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細(xì)胞后，分別收取4，8，12，24 h的細(xì)胞上清液，利用ELISA檢測試劑盒檢測IFN-β的生成量。

1.5 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平親本毒rL和重組病毒rL-BC 感染后，利用Western blot檢測IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平。

1.6 病毒 mRNA水平的測定重組病毒感染A549和DF-1細(xì)胞后提取RNA反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行熒光定量PCR，檢測感染后多種PRRs和IFN下游分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析通過GraphPad Prism 7.0軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析(ANOVA)，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒的毒力測定按照OIE標(biāo)準(zhǔn)測定MDT、ICPI、IVPI，結(jié)果顯示，親本毒和重組病毒的MDT均>90 h；測定ICPI時接種重組病毒的雞死亡2只(表1),表明中等毒力BC株V蛋白的插入能提升LaSota株的毒力，但與親本毒相比差別不大，仍屬于弱毒水平。

表1 重組病毒的生物學(xué)特性

2.2 病毒不同時間的感染效率測定親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細(xì)胞 4，8，12 h后其感染效率如圖1所示。通過觀察熒光發(fā)現(xiàn)，親本毒感染細(xì)胞的能力有限，只會感染少量的細(xì)胞，而重組病毒感染細(xì)胞的數(shù)量要多于親本毒，且12 h后已經(jīng)能感染大部分的細(xì)胞。表明在病毒感染過程中，V蛋白的表達(dá)能增加弱毒LaSota株的感染效率。

A.4 h rL；B.4 h rL-BC；C.8 h rL；D.8 h rL-BC；E.12 h rL；F.12 h rL-BC

2.3 病毒感染后IFN-β的生成親本毒rL和重組病毒rL-BC感染DF1細(xì)胞4，8，12，24 h后上清IFN-β的生成量如圖2所示。感染后8～24 h親本毒高于重組病毒，12 h時更是有顯著性差異(P<0.001)，這說明V蛋白的插入會抑制IFN-β的生成，從而降低抗病毒效應(yīng)。

圖2 病毒感染后上清液IFN-β的生成水平

2.4 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平親本毒rL和重組病毒rL-BC感染后IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平如圖3所示。結(jié)果顯示，插入外源V蛋白的重組病毒其P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)量低于親本毒，說明重組病毒對這2種蛋白的拮抗作用更強(qiáng)。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker；1.PBS；2.rL；3.rL-BC

2.5 病毒感染后先天性免疫的轉(zhuǎn)錄水平變化熒光定量檢測插入V蛋白的重組病毒rL-BC和親本毒rL感染后對A549和DF1細(xì)胞先天性免疫的影響，結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，重組病毒與親本毒相比，多種PRRs及IFN下游分子轉(zhuǎn)錄水平下降，其中IRF7和ISG15顯著下降(P<0.05)(圖4)；在DF1細(xì)胞中，重組病毒rL-BC比親本毒rL感染所誘導(dǎo)的IFN-α、IRF7、LGP2和TLR3轉(zhuǎn)錄水平下降顯著(P<0.05)(圖5)。說明ND中等毒力BC株V蛋白插入后多種重要先天性免疫分子表達(dá)量降低，表明NDV的V蛋白能夠抑制宿主對病毒感染后的先天性免疫反應(yīng)。

圖4 病毒感染A549細(xì)胞24 h后PRRs及IFN通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平

圖5 病毒感染DF1細(xì)胞24 h后PRRs及IFN通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

副黏病毒科是與黏液蛋白有特殊親和性的一類病毒[11]，NDV作為副黏病毒科的一員，中等毒力毒株和高強(qiáng)毒力毒株會引起多種禽類的嚴(yán)重呼吸道疾病甚至死亡[12]。近些年，NDV的感染及致病宿主范圍呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的趨勢[13]。NDV V蛋白在影響病毒毒力、抑制IFN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和宿主嗜性等方面起重要作用[14]。為探究BC中毒株V蛋白在病毒感染過程中對先天性免疫反應(yīng)的影響，本研究測定了rL-BC的毒力和不同時間的感染效率，還檢測了上清中IFN-β的含量以及P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平，最后檢測了感染后DF1、A549細(xì)胞的先天性免疫分子的轉(zhuǎn)錄水平。感染后的Western blot和RT-PCR的檢測結(jié)果顯示BC株V蛋白插入后會降低P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)以及多種PRRs如LGP2、TLR3和ISG15及IFN-α等IFN通路相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄水平。據(jù)報道，V蛋白對IFN的拮抗作用會影響病毒毒力[15]，V蛋白的缺失會引起病毒毒力的下降[16]，甚至無法在9日齡雞胚中存活。本試驗中V蛋白插入后重組病毒rL-BC的ICPI水平與親本毒相比有提升，破壞細(xì)胞的能力也強(qiáng)于親本毒，說明V蛋白插入提高了病毒毒力。NDV和另外幾種副黏病毒的V蛋白可以通過E3泛素連接酶環(huán)指蛋白5(RNF5)靶向MAVS造成泛素化降解，而MAVS的降解會導(dǎo)致IFN-β生成通路被抑制，從而有利于病毒的增殖[17]，也能通過參與ERK介導(dǎo)的信號通路促進(jìn)NDV的復(fù)制[3]。本試驗中重組病毒上清的IFN-β生成量低于親本毒也說明了V蛋白的插入會增強(qiáng)IFN的拮抗作用。另外，V蛋白還能與CacyBP/SIP相互作用[18]，靶向降解P-STAT1阻斷IFN-α信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制[19]。P-STAT1和MDA5蛋白的表達(dá)水平下降，也證明V蛋白確實可通過抑制先天性免疫反應(yīng)從而提高病毒毒力。

當(dāng)病毒侵入宿主時，宿主會產(chǎn)生抗病毒免疫反應(yīng)，其中IFN系統(tǒng)和PRRs及下游分子是宿主抵抗病毒感染的重要防線，在早期的天然免疫中發(fā)揮重要作用。近年來的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDV通過RNA編輯作用產(chǎn)生的V蛋白具有阻斷IFN抗病毒活性的功能，因而和病毒的致病性有著密切關(guān)系[20-22]，所以對V蛋白進(jìn)行研究對了解病毒致病機(jī)制有重要意義。本試驗測定rL-BC毒力和其對先天性免疫的影響，為后續(xù)探究V蛋白在感染過程中對IFN和先天性免疫反應(yīng)的拮抗作用的影響奠定基礎(chǔ)。