豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒感染狀態(tài)與抗體水平關聯(lián)性分析

張 偉，張子榮，楊力偉，王世銀，劉曉娜，張 力，王忠山

(1.新疆農業(yè)職業(yè)技術學院，新疆 昌吉 831100；2.新疆生產建設兵團第六師五家渠市畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 五家渠 831300；3.新疆生產建設兵團畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆 烏魯木齊 830063)

豬繁殖與呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在我國俗稱“藍耳病”，臨床上以母豬繁殖障礙與生長豬呼吸道疾病、生長遲緩以及死亡率增加為主要特征[1]。PRRSV包括基因1型(歐洲型)和基因2型(美洲型)2個基因型，我國目前檢測到的流行毒株主要為基因2型[2-3]。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)是一種突變能力很強的RNA病毒，這給該病的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)[4]。

我國于20世紀90年代中期暴發(fā)PRRS疫情。2007年我國將PRRS列入強制免疫計劃。近年來，通過PRRSV疫苗的持續(xù)免疫以及豬場防疫意識、生物安全水平的不斷提高，PRRS在我國的大規(guī)模流行得到了有效的控制。但由于PRRSV流行毒株復雜，而目前使用的PRRSV滅活苗和減毒活疫苗(MLV)產生的抗體對不同毒株的交叉保護效果不佳，免疫豬場PRRSV不定期活躍并表現(xiàn)臨床癥狀的情況仍普遍存在[5-6]，加之人們對PRRSV MLV毒株回復突變和毒力返強，以及疫苗毒株與豬群中流行的野毒重組產生新毒株的擔憂[7]，實際生產中對是否免疫PRRSV疫苗仍存在爭論。另外，免疫豬群和自然感染豬群體內PRRSV抗體水平與豬群中PRRSV的感染狀態(tài)具有怎樣的關系，以及如何通過豬群PRRSV抗體水平的監(jiān)測提前預判PRRSV的活躍狀態(tài),進而采取針對性的防控措施，生產中亦有不同的說法，這對我國PRRS的整體或者區(qū)域防控非常不利。

鑒于此，本研究在新疆北疆地區(qū)選擇了PRRSV感染情況和防控策略不同的3個規(guī)?；i場，對豬群中PRRSV感染和抗體消長情況進行了為期2年的監(jiān)測，并結合豬群整體生產性能及病毒血癥的發(fā)生比例分析了兩者之間的關聯(lián)性，旨在為實際生產中PRRSV的科學防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒為IDEXX公司(美國)生產的PRRS X3抗體檢測試劑盒；柱式RNA核酸提取試劑盒為AXYGEN公司產品；Taq DNA聚合酶，dNTP Mix，AMV反轉錄酶，RNase抑制劑，pMD18-T質粒均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為OMEGA公司產品；感受態(tài)DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器酶標儀、洗板機及普通PCR儀均購自BIO-RAD公司；實時熒光定量PCR儀購自Roche公司；冷凍高速離心機購自Thermofisher公司。

1.3 豬場選擇在新疆北疆地區(qū)選擇3個規(guī)?；i場，均采用單點式養(yǎng)殖模式，具有較為完備的生物安全體系。3個豬場PRRSV感染情況和防控策略如下：

A場免疫PRRSV MLV(TJM-F92株)，各階段豬群生產性能穩(wěn)定，未表現(xiàn)PRRS臨床癥狀。免疫程序：種豬每年普免3次，商品豬14日齡首免，1個月后加強免疫1次。

B場2018年前未免疫PRRSV疫苗，3.0%～5.0%的母豬流產或產死胎、木乃伊胎，保育階段成活率80.0%～85.0%，主要表現(xiàn)為厭食、呼吸困難、精神沉郁、毛發(fā)粗亂等癥狀，最終逐漸消瘦死亡。自2018年4月起開始免疫PRRSV MLV(TJM-F92株)，至2018年10月各階段豬群生產性能逐漸穩(wěn)定至較高水平，僅有個別豬表現(xiàn)PRRS臨床癥狀。免疫程序：2018年種豬每年普免4次，商品豬7日齡首免，3周后加強免疫1次；2019年后調整為種豬每年普免3次，商品豬14日齡首免，1個月后加強免疫1次。

C場2018年前為PRRSV陰性場，2018年3月保育階段首先暴發(fā)PRRS并很快波及母豬群，20.0%～30.0%的母豬流產，保育階段豬表現(xiàn)典型的PRRS癥狀，成活率僅為65.0%～70.0%。豬場通過拌料結合肌注抗菌類藥物控制細菌繼發(fā)感染，同時加強飼養(yǎng)管理，落實嚴格的生物安全措施，使豬群完成自然感染，至2018年11月豬群生產性能基本恢復穩(wěn)定，僅保育及育肥階段偶有輕微的PRRS臨床癥狀。

1.4 樣品采集從2018年1月至2019年12月，上述3個豬場每隔3個月采集血樣進行PRRSV抗體和抗原檢測。血樣通過前腔靜脈采集，分離血清進行PRRSV抗體監(jiān)測，采樣方案為公豬全部采集，后備母豬、妊娠中期母豬和哺乳母豬按照群體數(shù)量的10.0%隨機采樣，哺乳仔豬(約10日齡)、保育豬(約40和60日齡)和生長育肥豬(約80日齡)每個單元每次隨機采集50頭份血樣(表1)?？贵w陽性血樣混樣(5個血樣混合為1個樣品)使用qRT-PCR檢測PRRSV，以評估檢測豬群表現(xiàn)病毒血癥的情況。另外，每批抗體陽性血樣按照S/P值為0.4～2.5，2.6～3.0以及>3.1共3個等級分別選擇20份血樣使用qRT-PCR檢測PRRSV抗原以評估不同S/P值個體發(fā)生病毒血癥的比例。

表1 調查豬場血樣采集數(shù)量 份

1.5 PRRSV抗體及抗原檢測參照IDEXX PRRSV X3 ELISA抗體檢測試劑盒操作說明測定血清中PRRSV抗體并計算S/P值，結果判定標準：抗體S/P<0.4為陰性，S/P≥0.4為陽性。

血清中PRRSV抗原檢測采用本實驗室建立的PRRSV qRT-PCR檢測體系完成。引物以PRRSV ORF5基因序列(NC_001961)為參考序列，使用Oligo 6.0軟件設計，并由生工生物工程(上海)有限公司合成,qRT-PCR引物信息見表2。參照試劑盒說明提取血清中的病毒RNA，然后反轉錄為cDNA。qRT-PCR檢測采用20.0 μL擴增體系：10×Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 2.0 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，引物PRRSV-qP(10 μmol/L)各0.5 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。qRT-PCR反應在Roche LC96上完成。

表2 PRRSV ORF5測序引物及qRT-PCR引物

1.6 PRRSV ORF5基因克隆及測序分別從B和C場隨機選擇2018年3月和2019年3月PRRSV抗原陽性血清中各10份進行PRRSV ORF5基因克隆測序，以確定其感染毒株。以病毒cDNA為模板，使用克隆引物PRRSV-P(表2)擴增PRRSV ORF5基因。采用50.0 μL擴增體系：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，引物PRRSV-P(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95℃預變性30 s；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共計40個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產物切膠回收，連接T載體后轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR鑒定陽性菌落送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行雙向測序。

1.7 PRRSV ORF5基因序列比對及遺傳進化分析檢索GenBank數(shù)據庫，以國內PRRSV主要流行毒株ORF5基因序列作為參考序列(表3)，使用DNAStar軟件的Clustal W算法比對本研究獲得ORF5基因序列和參考序列的同源性，以確定豬場感染的毒株，并使用Mega 6.0繪制進化樹。

表3 序列比對參考毒株信息

2 結果

2.1 調查豬場PRRSV抗體檢測結果從表4數(shù)據可以看出，A場通過持續(xù)免疫PRRSV MLV，豬群各個階段PRRSV抗體檢測數(shù)據均表現(xiàn)良好，在2年的監(jiān)測期間，種公豬抗體陽性率100.0%，后備母豬、妊娠母豬和哺乳母豬抗體陽性率亦保持在95.0% 以上，且后備母豬2018年3月抗體離散度為42.0%以外，其他階段均低于40.0%，種公豬群抗體離散度甚至可控制在20.0%左右，且全期未檢測到抗體S/P≥2.5的樣本，種豬群PRRSV抗體S/P值穩(wěn)定在1.8～2.3。商品豬群在2次藍耳疫苗免疫后抗體陽性率亦可達到85.0%以上，抗體離散度達到50.0%以下，抗體S/P值穩(wěn)定在1.8～2.1。上述檢測結果與該場豬群良好的健康狀況及生產性能相一致。

從表5數(shù)據可以看出，B場在2018年4月份免疫PRRSV MLV前豬群PRRSV抗體各項指標均不理想，種豬群抗體陽性率為60.0%～78.0%，抗體離散度99.0%～115.0%，抗體S/P≥2.5的樣本比例為10.0%～30.0%。商品豬群PRRSV抗體各項指標亦很差，80日齡仔豬階段抗體S/P≥2.5的樣本比例高達73.0%。上述檢測數(shù)據與該場當時豬群生產性能低下，PRRS臨床癥狀明顯等實際情況相符。

表5 B場PRRSV抗體檢測結果 %

2018年4月份免疫疫苗后至2018年6月份，豬群PRRSV抗體各項指標逐漸出現(xiàn)好轉，至2018年12月份種豬群抗體陽性率90.0%以上，抗體離散度50.0%以下，抗體S/P≥2.5的樣本比例低于5.0%，抗體S/P值平均值為0.9～1.2。商品豬群各項指標改善的相對較慢，至2019年3月基本達到較理想的水平，抗體離散度小于50%，抗體S/P≥2.5的樣本比例低于5.0%，抗體S/P值平均值為0.8～1.1。在2018年10月份，豬群生產性能和PRRS臨床癥狀已有明顯改善，至2019年3月豬場各項生產指標均達到較高水平。

從表6的數(shù)據可以看出，C場自2018年3月份暴發(fā)PRRS后豬群抗體迅速轉陽，陽性率高達90.0% 以上，至2018年6月種豬群抗體陽性率95.0% 以上，抗體S/P≥2.5的樣本比例為8.0%～13.0%，抗體S/P值平均值為1.6～2.0，商品豬60日齡仔豬群中抗體S/P≥2.5的樣本比例高達41.0%。這與該場同期母豬大量流產，仔豬死亡率高等臨床表現(xiàn)相一致。至2018年12月份豬群基本完成了自然感染，PRRSV抗體各項指標得到根本改善，種豬群中抗體S/P≥2.5的樣本比例控制在5.0% 以下，至2019年3月以后種豬群中再未檢測到抗體S/P≥2.5的個體，豬群抗體S/P值穩(wěn)定在1.2以下，且種豬群抗體在逐漸轉陰，至2019年12月份種豬群PRRSV抗體陽性率已降至31.0%～41.0%，平均S/P值在0.4～0.8，種豬生產性能亦恢復正常。但該場保育后期PRRSV抗體又重新轉陽，說明豬群又重新感染了PRRSV。

表6 C場PRRSV抗體檢測結果 %

2.2 調查豬場PRRSV抗原檢測結果從表7數(shù)據可以看出，A場檢測期間所有血清樣本中均未檢出PRRSV抗原；B場種豬群2018年4次檢測中分別在8.3%，5.1%，6.6%和2.1%的血清樣本中檢測到了PRRSV，但陽性率在逐步下降，至2019年除了6月份檢測到0.5%的陽性樣本以外，其余3次均未檢測到PRRSV；商品豬群血清樣本中PRRSV的檢出率亦在持續(xù)降低，至2019年9月以后已全部轉陰。C場種豬群2018年4次檢測中,分別在11.5%，9.3%，4.3%和5.1%的血清樣本中檢測到了PRRSV，陽性率總體呈下降趨勢，至2019年4次檢測種豬群中再未檢出陽性個體；商品豬群在2年的監(jiān)測期中始終可以檢測到PRRSV陽性樣本，說明PRRSV仍在商品豬群中循環(huán)。

表7 調查豬場PRRSV抗原陽性率檢測結果 %

2.3 調查豬場不同PRRSV 抗體S/P值陽性血清的抗原陽性率由表8數(shù)據可以看出，B和C場PRRSV抗體S/P值在0.4～2.5的血清樣本，使用qRT-PCR均未檢測到PRRSV抗原，提示抗體S/P值在此范圍的豬未發(fā)生病毒血癥；S/P值在2.6～3.0的血清樣本，分別有15.0%和54.0%檢測到PRRSV抗原，而S/P>3.1的血清樣本，分別有78.0% 和100.0% 檢測到PRRSV抗原，提示免疫豬群中S/P值異常高的個體表現(xiàn)病毒血癥的比例亦迅速增高，而非免疫豬群中S/P>3.1的個體100.0%表現(xiàn)病毒血癥。

表8 不同PRRSV 抗體S/P值陽性血清抗原陽性率

2.4 調查豬場PRRSV ORF5基因克隆及測序40份血清均通過PCR擴增獲得大小為754 bp的條帶(圖1)，擴增片段符合預期大小。PCR鑒定陽性菌落(圖1)經測序及序列比對發(fā)現(xiàn)，B場20個樣品PRRSV ORF5基因測序結果中分別有11和9條序列相同，分別命名為XJ-01和XJ-02；C場20個樣品測序結果均相同，命名為XJ-03。以上結果說明B和C場分別有2和1個流行毒株，且在2年的檢測期內豬場再未感染新的毒株。

M．DL100 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.部分血清PCR產物;6～9.部分菌落PCR產物

2.5 調查豬場PRRSV ORF5基因核苷酸序列同源性分析將XJ-01、XJ-02和XJ-03共3個毒株ORF5基因核苷酸序列與16個國內流行參考毒株進行序列比對，發(fā)現(xiàn)XJ-01、XJ-02和XJ-03毒株分別與JXA1、CH-1a和JXA1毒株ORF5基因序列的同源性最高，分別達到99.8%，99.7%，99.8%，XJ-01和XJ-03毒株與JXA1、TJ、WHH4、GD、HuN4和SXHZ01等毒株ORF5基因序列的同源性也高于99.0%。由于上述毒株均為HP-PRRSV毒株，說明B和C場均有HP-PRRSV毒株感染，同時B場還受PRRSV經典毒株的混合感染(圖2，3)。

圖2 調查豬場PRRSV流行毒株與國內主要毒株ORF5基因核苷酸序列同源性分析

3 討論

3.1 豬群PRRSV抗體監(jiān)測結果與豬群生產性能的關系目前包括IDEXX PRRS X3在內的PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒，檢測到的是PRRSV N蛋白產生的抗體。但是由于N蛋白產生的抗體無中和病毒的作用[8]，所以測得的PRRSV抗體水平與其保護力沒有直接的對應關系，這給PRRSV抗體檢測結果的分析帶來了很大的困難。

鑒于以上原因，豬場需要結合本場豬群的生產性能、PRRS臨床表現(xiàn)等，對PRRSV抗體檢測結果進行針對性分析，才能對豬群PRRSV的穩(wěn)定情況做出比較客觀的評價?？禈迦A等[9]對9個種豬場的檢測數(shù)據表明，具有較好生產成績的豬場，其PRRSV抗體基準線的區(qū)間范圍為抗體S/P值平均值為1.0～2.0，離散度為50.0%～70.0%，呈動態(tài)平穩(wěn)變化。吳靜波等[10]對粵北地區(qū)4個規(guī)?；i場的研究結果表明，豬群生產性能良好的豬場PRRSV抗體陽性率總體應在70.0%～80.0%，抗體S/P值平均值為0.8～1.2，離散度在25.0%左右，S/P值≥2.5的豬只占豬群5.0%以下。本研究中，3個調查豬場PRRSV抗體各項指標亦與豬群生產性能有很好的對應關系。所以，對豬場PRRSV抗體檢測結果進行評價時，除了重視抗體陽性率以外，抗體S/P值平均值、離散度是否處于合理的范圍，以及S/P值≥2.5的樣本數(shù)量的高低是需要重點關注的3個指標。

圖3 調查豬場PRRSV流行毒株與國內主要毒株ORF5基因遺傳進化樹

另外，3個調查豬場同批次血清樣本PRRSV抗原qRT-PCR的檢測結果表明，血清樣本PRRSV抗體S/P值與抗原陽性率高度相關，PRRSV抗體S/P值大于2.5的血清抗原陽性率將迅速升高。吳靜波等[10]的檢測結果亦表明，S/P值為0.4～2.5的豬群病毒血癥的發(fā)生率為7.3%，其中在S/P值為0.8～1.2的豬群病毒血癥的發(fā)生率為0，而73.3%的抗原陽性血清S/P值處于異常范圍(<0.4或>2.5)，與本研究結果基本一致。

通過C場的檢測數(shù)據可以看出，采取自然感染或血清馴化的豬場，待豬群生產性能穩(wěn)定后，PRRSV抗體陽性率、S/P值平均值、以及S/P值≥2.5的樣本數(shù)量應逐步下降，若上述指標持續(xù)保持高水平或者某個階段出現(xiàn)重新升高的情況，則說明存在PRRSV持續(xù)感染或者反復感染的情況。但是隨著豬群中陰性個體數(shù)量的不斷增加，豬場再次暴發(fā)PRRS的風險也會相應上升。周慶華等[11]調查的豬場PRRS暴發(fā)后通過血清馴化使豬群達到PRRSV陽性穩(wěn)定，但該場在保持陽性穩(wěn)定2年后又重新暴發(fā)了PRRS。

3.2 新疆PRRSV流行情況有關新疆PRRSV流行毒株的研究報道相對較少，趙潔雅等[12]從新疆某豬場分離到NADC30-like毒株，范士龍等[13]也從一個存在嚴重母豬繁殖障礙豬場中檢測到了NADC30-like毒株，說明該毒株已在新疆逐步蔓延。本研究通過PRRSV ORF5基因測序證明B和C場存在PRRSV JXA1和CH-1a毒株的感染，未檢測到NADC30-like毒株，但鑒于PRRSV是一種高度傳染性病毒，各豬場仍應嚴格落實生物安全措施，避免PRRSV新毒株進入豬場。