浙江近年育成粳稻新品種(系)部分抗病蟲基因的分子檢測與育種應(yīng)用

黃 宣， 金林燦， 葉朝輝， 姜潔鋒， 施賢波

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 作物研究所，浙江 寧波 315040)

水稻(Oryzasativa)作為全球最重要的糧食作物之一， 養(yǎng)育著全世界半數(shù)以上的人口，我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費國之一[1]。即使在越來越科學(xué)的管理下，水稻在大田生產(chǎn)過程中仍避免不了病蟲害的威脅[2]。稻瘟病[3]、白葉枯病[4]、褐飛虱[5]是水稻生產(chǎn)上主要病蟲害， 會對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響。農(nóng)藥防治成本較高并且容易污染環(huán)境，選用聚合不同抗性基因的多抗品種是保障水稻綠色生產(chǎn)的重要途徑。因此，針對這些病害的抗性基因定位和克隆工作一直備受關(guān)注。近年來，研究人員就水稻稻瘟病、白葉枯病、褐稻虱抗性基因進行了較為深入的系統(tǒng)研究。利用分子標記手段定位到100多個稻瘟病主效抗性基因，已克隆36個[6]；利用形態(tài)標記和分子標記定位抗白葉枯病基因40 個，已被定位的抗性基因有 32 個，其中被克隆的基因有 9個[4]；目前國際上已確認并在期刊上報道的水稻抗褐飛虱基因有43個，其中38個已被定位[7]，Bph3 (Bph17)、Bph14、Bph26 (Bph2) 和Bph29 已經(jīng)被克隆[5]。基于以上抗性基因序列，人們開發(fā)了一系列特異性分子標記[8-10]，利用分子標記輔助選擇技術(shù)快速、準確、系統(tǒng)地從大量水稻材料中鑒定抗病蟲基因，為抗病蟲水稻新品種培育帶來了新契機，提高了育種效率。

水稻是浙江省的主要糧食作物，在糧食生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[11]。浙江省水稻種植基本呈“南秈北粳”的特點，秈稻推廣面積占水稻生產(chǎn)面積的 44.0%左右，粳稻占 56.0%左右，近年來，粳稻面積有增加的趨勢[12]。浙江省在水稻生長季節(jié)高溫多雨，臺風(fēng)多，稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱等病蟲害高發(fā)。目前，普遍認為培育抗病蟲水稻新品種是提高品種抗性最經(jīng)濟有效的措施[13]。明確近年來育成的常規(guī)晚粳稻品種(系)的抗病蟲基因組成是基于分子標記輔助選擇技術(shù)改良品種抗性的重要前提。何海燕等[14]對40份浙江省水稻主栽品種中5個稻瘟病抗性基因進行了分子檢測，初步明確了這些稻瘟病抗性基因的分布情況。蘭波等[15]利用特異性分子標記技術(shù)對44份江西早秈雜交稻的9個抗稻瘟病基因進行檢測，初步明確了抗性基因在江西稻區(qū)早秈雜交稻的分布。本研究以Pigm、Pi2、Pita等十一個抗稻瘟病基因，Xa21、Xa23兩個抗白葉枯病基因，及Bph14、Bph15兩個抗褐飛虱基因為研究對象，應(yīng)用特異性功能標記對浙江省近年其新育成的61份常規(guī)晚粳品種(系)中的抗病蟲基因進行分子檢測，分析其在水稻中的分布和應(yīng)用情況，并利用部分抗性基因來改良本地品種的抗病蟲性，驗證其抗性，以期為通過分子聚合育種技術(shù)選育多抗水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試61份常規(guī)晚粳稻品種(系)為浙江省內(nèi)7家育種單位近年來(2008—2019年)育成或生產(chǎn)中推廣的14個品種，以及參加聯(lián)合品比試驗或區(qū)試的47份優(yōu)秀品系(表1)。所有材料于2020年種植在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水稻育種基地內(nèi)。

表1 供試品種(系)名稱及來源

1.2 DNA提取與檢測

每個品種采集1個單株的2 cm長葉片，放置離心管中并加入2～3顆鋼珠，加入CTAB抽提液在凈信Tissuelyser-II組織研磨儀上對樣品葉片進行研磨，按步驟提取DNA，采用1.5%瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量，加入適量無菌水(ddH2O)溶解后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 PCR擴增

檢測采用PCR擴增方法。本研究所用抗稻瘟病、抗白葉枯病、抗褐飛虱PCR特異性引物信息見表2，委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物。10 μL的PCR反應(yīng)體系包含DNA模板1 μL、10 μmol·L-1正反向引物各1 μL、2×Easytaq PCR SuPerMix 3 μL，ddH2O 4 μL。在PCR儀上進行擴增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30～35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

表2 用于PCR反應(yīng)的引物名稱、序列及預(yù)期片段長度

1.4 產(chǎn)物檢測

抗病基因的擴增產(chǎn)物用添加GelStain核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標記檢測結(jié)果

利用15個抗病蟲功能標記對供試的61份粳稻品種(系)進行檢測，結(jié)果顯示，所有材料均未擴增出抗稻瘟病基因Pi1和抗白葉枯基因Xa21和Xa23的抗病條帶，剩余的12個抗病蟲基因則在61個材料中有不同程度的分布(圖1、圖2)：其中Pigm基因檢出率最低為1.64%，只在來源于浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院的品系R1825中檢出；Pb1、Bph14、Bph15三個抗性檢出率較低，分布頻率分別為6.56%、6.56%、11.48%；Pish/Pi54、Pi9、Pi5、Pit檢出頻率分別為24.59%、26.23%、32.79%、34.43%；分布頻率在65%左右的基因有3個，分別為Pita、Pi2、Pikm；檢出率最高的抗性基因Pib，達到91.80%，即61份材料中有56份材料中含有Pib。浙江新育成61份粳稻中品種(系)中稻瘟病分布頻率從高到低分別為Pib>Pikm>Pi2>Pita>Pit>Pi5>Pi9>Pish/Pi54>Pb1>Pigm>Pi1(圖3)。

圖1 十五個抗性基因在61個常規(guī)晚粳稻品種(系)中的分布

M，DL2000；Pigm對照為谷梅四號；Bph14、Bph15對照為B5。瓊脂糖電泳泳道1～30 ： 寧88、寧84、寧81、寧39、丙17-02、紹粳19-34、HZ16-78、丙19-26、R9079、丙19-339、春江190、ZH19-02、浙糯106、紹糯9714、ZH19-12、浙粳96、R1825、丙16-135、ZH16-98、甬粳19-46、春江糯8號、HZ-1137c、嘉禾628、R182、嘉16-48、春江糯7號、紹粳18、嘉124、甬粳18-60和秀水134。

就品種(系)而言，61份供試材料均有抗性基因檢出，檢出數(shù)量在2～8個。其中甬粳19-46、臺19-84、紹粳19-34、嘉60四份材料只攜帶兩個抗性基因，中嘉8號、寧84、寧88等33份材料有3～4個抗性基因被檢出，攜帶5～6個抗性基因的材料有20份，攜帶7～8個抗性基因的材料有4份，分別為丙17-204、丙17-02、丙16-135、丙16-111(表4)。以上結(jié)果表明，浙江粳稻品種(系)在攜帶的已知抗稻瘟病基因上存在明顯差異，Pikm、Pita、Pi2和Pib總體應(yīng)用較廣，其中Pib的應(yīng)用最廣。抗褐飛虱基因Bph14、Bph15在61份材料中檢出率較低，只在嘉興農(nóng)科院“丙”系列材料中和中國水稻研究所“春江”系列中有檢出，而同時檢出Bph14、Bph15基因的材料有4份，分別為丙19-26、丙17-02、丙16-135、丙16-111。

表4 六十一個水稻品種(系)抗性基因分子標記檢測

2.2 部分抗病蟲基因的育種利用

由于在供試材料中未檢測到攜帶Xa23基因的品種(系)，本研究利用含有Xa23基因的秈稻品系R416和中感白葉枯病的粳稻品種寧84雜交，以寧84為輪回親本，通過分子標記輔助選擇將Xa23導(dǎo)入寧84背景中，在BC1F1代利用剪葉法進行白葉枯病接種，混合菌液由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與微生物研究所提供，對含有Xa23的單株抗病效果進行了初步評價。結(jié)果顯示，含有Xa23基因的單株均表現(xiàn)為高抗，未檢出的為中感(圖3)，初步表明，Xa23可以增強粳稻對白葉枯病的抗性。

M，DL2 000；Xa23的對照為R416。

為驗證抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的在粳稻中的抗性，本研究利用含有抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的種質(zhì)丙16-111和不含抗褐飛虱基因的晚粳品種寧84、寧88雜交，雜交分離后代通過分子標記輔助選擇含有Bph14、Bph15基因且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的單株，在F5代對基本穩(wěn)定的品系委托武漢大學(xué)何光存實驗室進行褐飛虱抗性鑒定，鑒定方法采用標準苗期集團法，每份材料重復(fù)3次。當感蟲材料TN1死苗率達到95%左右時，按照國際水稻所的標準對每個重復(fù)的待鑒定水稻材料分別進行讀數(shù)，最后計算平均值。結(jié)果表明，不含有Bph14、Bph15基因的品種寧84、寧88抗性結(jié)果為感蟲，導(dǎo)入Bph14、Bph15的品系均達到抗以上級別(表3)，結(jié)果表明，聚合了2個抗蟲基因的水稻品系，相對于只有1個抗蟲基因的水稻品系來說，對害蟲具有更強的趨避性和抗生性(圖4)。

圖4 水稻材料對褐飛虱的抗性表現(xiàn)

3 結(jié)論與討論

稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱是水稻三大病蟲害，浙江省品種審定委員會將稻瘟病、白葉枯病、褐飛虱抗性作為水稻品種審定的主要衡量指標。因此，水稻抗病基因的定位克隆和分子機理研究一直是生物學(xué)家和育種家關(guān)注的焦點。隨著越來越多抗稻瘟病基因的定位、克隆，一大批基因特異性分子標記被成功開發(fā)，如Pita、Pib、Pit、Pb1等[16-18， 23-24]，為抗病育種帶來了新的契機。

本研究利用15個抗病蟲功能標記對61份浙江新育種的粳稻品種(系)進行分子檢測，結(jié)果表明,浙江新育成品種(系)中未檢測到抗稻瘟病基因Pi1，其他抗稻瘟病基因都有不同程度的分布。Pi2、Pi9、Pigm等是位于第 6 染色體短臂靠著絲粒附近的一個抗性基因簇，它們雖然存在一定的抗譜差異，但對不同地區(qū)來源的絕大多數(shù)稻瘟病菌都具有良好的抗性[29]。何海燕等[22]2019年研究表明，Pi2、Pi9對浙江省稻瘟病生理小種的抗性頻率分別為58.87%和60.99%，具有較廣的抗譜，本研究表明，浙江新育種粳稻品(系)中Pi2基因的分布頻率為67.21%，Pi9基因的分布頻率為26.23%，說明Pi2基因在浙江粳稻中得到了較廣泛的應(yīng)用，Pi9基因的利用應(yīng)該加強。Pigm是從四川秈稻“谷梅4號”中分離鑒定的一個廣譜持久抗性基因，有研究表明，Pigm基因?qū)Φ疚敛∩硇》N的抗性頻率高達91.9%，抗譜較等位基因Pi2、Pi9等更廣，達75%左右，且在粳稻中幾乎不存在該基因[30-31]，本研究中Pigm分布頻率僅為1.64%，61份品系中只有1份品系被檢測到Pigm基因，說明Pigm基因在浙江粳稻中初步得到應(yīng)用，未來應(yīng)進一步加強其在粳稻育種中的應(yīng)用研究。Pib和Pita是最早克隆的兩個具有廣譜抗性的稻瘟病基因，它們普遍存在于中國現(xiàn)有粳稻栽培品種中，據(jù)陳濤等[31]研究，在江蘇粳稻中Pita、Pib的分布頻率分別為45.8%、 64.6%，且Pita、Pib組合表現(xiàn)出良好的抗性，而本研究中Pita和Pib的分布頻率為63.93%、91.80%，說明這兩個基因在浙江粳稻中比江蘇粳稻得到更廣泛的利用。另外Pik位點的Pikh/Pi54、Pikm都在浙江粳稻中有一定的分布。本研究中浙江新育成粳稻品種(系)均攜帶多個抗稻瘟病基因，最少的2個，最多的有6個，據(jù)相關(guān)研究證明攜帶抗病基因并不代表表型抗病[15， 32]，抗性水平既與抗性基因數(shù)量的累加有關(guān)，亦與抗性基因之間的互作有關(guān)。掌握水稻品種的抗稻瘟病基因型是改善水稻抗稻瘟病育種工作合理布局的基礎(chǔ)，也是改良優(yōu)質(zhì)水稻抗性資源和培育抗病新種質(zhì)的有效途徑。

續(xù)表4 Continued Table 4

水稻白葉枯病是水稻最嚴重的病害之一，是由革蘭氏陰性菌黃單胞桿菌水稻變種侵染引起的細菌性病害。Xa21為成株期廣譜高抗白葉枯病基因[33]，Xa23基因則表現(xiàn)高抗、完全顯性和全生育期抗性[28]。本研究中在浙江新育成的61個粳稻新品種(系)中均未檢測到這2個基因，表明在浙江粳稻種中還沒用到這2個基因資源，浙江粳稻中的抗白葉枯病基因型有待進一步明確。王付華等[34]研究表明，在20個沿黃粳稻中也未檢測到Xa21，而Xa23的分布頻率是60%。本研究中利用秈稻中的Xa23導(dǎo)入粳稻寧84中，在BC1F1中利用剪葉法接種發(fā)現(xiàn)Xa23能顯著的增強粳稻的抗性。因此，在未來的育種工作中，要針對性開展Xa23 和Xa21抗性基因水稻資源的引進與利用，進一步提高浙江粳稻對白葉枯病的抗性。

褐飛虱，屬同翅目飛虱科，能遠距離遷飛，是中國和許多亞洲國家當前水稻首要害蟲。本研究中利用抗褐飛虱Bph14、Bph15功能標記對浙江61水稻新品種(系)進行檢測，結(jié)果顯示，同時檢出Bph14、Bph15基因的材料有4份，均來源于嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，說明嘉興農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在育種中重視對褐飛虱抗性基因的利用，為今后粳稻抗褐飛虱育種提供了良好的抗源。蔡之軍等[35]研究利用分子標記技術(shù)將B5 中抗褐飛虱基因Bph14、Bph15導(dǎo)入浙北當家栽培粳稻品種秀水134、嘉58中，結(jié)果表明B5 攜帶的抗性基因在粳稻背景中能夠有效表達，能夠增強褐飛虱抗性。本研究利用含有Bph14、Bph15基因的丙16-111與寧88、寧88雜交，通過分子標記輔助選擇在F5代對含有Bph14、Bph15的單株進行抗性鑒定，結(jié)果表明，導(dǎo)入Bph14、Bph15的株系均達到抗以上級別。本研究結(jié)果與蔡之軍等[35]的研究結(jié)果相同，說明Bph14、Bph15在浙江粳稻育種中具有較高的利用價值。

本研究結(jié)果表明，浙江省新育成的常規(guī)晚粳稻品種(系)具有多個抗稻瘟病基因，未檢測到Pil基因，部分品系中含有抗褐飛虱基因Bph14、Bph15，未檢測到抗白葉枯基因Xa21、Xa23，可能從一定程度上反映出浙江新育成水稻品種(系)部分抗蟲害抗性基因的分布情況。抗白葉枯基因Xa23、抗褐飛虱基因Bph14、Bph15在粳稻育種應(yīng)用表明以上3個基因均具有良好的應(yīng)用前景，其他抗病基因的實際抗性效果還需要通過田間檢測進行驗證。本研究結(jié)果為今后利用分子標記輔助技術(shù)將多個目標抗性基因轉(zhuǎn)移到這些待改良品種中，從而培育廣譜多抗水稻新品種提供了科學(xué)依據(jù)。