2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)豬腸上皮細(xì)胞活力及線粒體功能的影響

魯慧杰 張 瑩 田志梅 容 庭 劉志昌 鄧 盾 馬現(xiàn)永，2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000)

腸道系統(tǒng)具有機(jī)體最大的黏膜表面，由能夠持續(xù)自我更新的單層腸上皮細(xì)胞構(gòu)成，是腸道微環(huán)境和黏膜免疫系統(tǒng)之間的屏障，一定程度上保護(hù)機(jī)體免受腸道內(nèi)有毒物質(zhì)和外界環(huán)境的傷害[1]。腸黏膜屏障通過腸上皮細(xì)胞感受和響應(yīng)外界刺激，是機(jī)體抵御潛在有害微生物和抗原的第一道防線，也是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下最早和最易受到氧化損傷的位點(diǎn)[1-3]。動(dòng)物生長中面臨的飲食、藥物、病原體、環(huán)境變化等應(yīng)激因素會(huì)引起腸道氧化應(yīng)激，刺激腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和促炎癥介質(zhì)，破壞腸上皮穩(wěn)定，導(dǎo)致腸黏膜屏障受損，引發(fā)吸收障礙、炎癥性腸病、消化系統(tǒng)退行性疾病甚至是癌癥[4-5]。

研究表明，斷奶、高溫、運(yùn)輸、病原菌、營養(yǎng)缺乏、飼料污染等諸多應(yīng)激因素導(dǎo)致動(dòng)物腸道ROS過度積累，引起腸上皮細(xì)胞損傷，腸道通透性增加，破壞腸上皮屏障功能，引發(fā)吸收障礙、腹瀉等炎癥性腸病和腸道應(yīng)激綜合征[6-8]。由斷奶引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)延緩仔豬生長，增加胃腸道系統(tǒng)對(duì)疾病的易感性，降低仔豬腸道消化酶活性，破壞緊密連接蛋白，損害腸道免疫系統(tǒng)和黏膜屏障功能，導(dǎo)致“斷奶后應(yīng)激綜合征”[9-10]。Smith等[11]認(rèn)為仔豬早期斷奶可能會(huì)對(duì)胃腸道系統(tǒng)產(chǎn)生長期影響，造成腸道黏膜屏障持續(xù)性損傷和永久性缺陷。Yu等[12]研究表明，高溫應(yīng)激導(dǎo)致豬小腸上皮細(xì)胞脫落，暴露腸黏膜固有層，改變空腸基因表達(dá)模式；超微結(jié)構(gòu)顯示空腸微絨毛變短、細(xì)胞線粒體腫脹、腸上皮細(xì)胞緊密連接破壞等。在這些生理過程中，腸上皮細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特性，這些特性由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能是決定細(xì)胞命運(yùn)以及協(xié)調(diào)細(xì)胞代謝、免疫力、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，許多細(xì)胞特異性應(yīng)激反應(yīng)是響應(yīng)線粒體功能障礙而引起的[13]。因此，建立穩(wěn)定的腸上皮細(xì)胞氧化損傷模型，闡明氧化損傷對(duì)線粒體功能的影響，對(duì)于研究動(dòng)物腸上皮細(xì)胞氧化損傷的響應(yīng)機(jī)制、尋找調(diào)控氧化損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)、測(cè)試具有抗氧化活性的藥物具有十分重要的意義。

本研究使用廣泛報(bào)道的自由基引發(fā)劑2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)作為氧化應(yīng)激模型的自由基來源。AAPH是一種水溶性偶氮小分子化合物，可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷引起各種類型的病理變化[14]。AAPH在37 ℃下以已知且恒定的速率持續(xù)分解生成1摩爾氮自由基和2摩爾碳自由基，其中碳自由基可以結(jié)合生成穩(wěn)定的產(chǎn)物，也可以與分子氧反應(yīng)生成過氧自由基(ROO·)[14-15]。其他常用的自由引發(fā)劑如過氧化氫(H2O2)的濃度和穩(wěn)定性具有不可預(yù)測(cè)性，因其在過渡金屬存在的條件下能夠自發(fā)的或者由超氧化物歧化酶(SOD)介導(dǎo)的歧化作用轉(zhuǎn)化為極端活躍的羥基自由基(HO·)，極易被細(xì)胞培養(yǎng)液中存在的抗氧化劑淬滅[15]。因此，這些特性使AAPH相比H2O2而言是更為穩(wěn)定可靠的自由基來源，更適用于抗氧化作用相關(guān)的研究[15-16]。目前，AAPH已被廣泛用作自由基引發(fā)劑，用于研究紅細(xì)胞、血漿、全血、Hela細(xì)胞、各種組織、胚胎甚至動(dòng)物個(gè)體的氧化應(yīng)激[17]。豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)來源于初生仔豬空腸的未轉(zhuǎn)化的豬腸上皮細(xì)胞系，保留了豬腸上皮的特性，是研究豬腸道宿主與外界因子相互作用的良好模型[18-20]。本試驗(yàn)以IPEC-J2細(xì)胞為對(duì)象，研究AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力及線粒體相關(guān)功能的影響，旨在建立一種穩(wěn)定的IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷模型，有助于研究腸上皮細(xì)胞氧化損傷的響應(yīng)機(jī)制和關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，為生產(chǎn)應(yīng)用中開發(fā)安全、高效的飼用抗氧化劑提供可靠的模型和潛在作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

AAPH購于美國Sigma-Aldrich公司；DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.2)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(0.25%)和雙抗(青霉素-鏈霉素)購于美國Thermo Fisher公司；動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；iTap Universal SYBR Green Supermix定量預(yù)混液購于美國Bio-Rad公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)、細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)測(cè)試劑盒購自上海東仁化學(xué)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-J2細(xì)胞在含有10% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至85%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞鋪板或傳代，鋪板前吸取10 μL細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞活力

將細(xì)胞懸液接種在96孔板中，密度為2×104個(gè)/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，用含有不同濃度AAPH的培養(yǎng)基處理細(xì)胞，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)。前期預(yù)試驗(yàn)處理時(shí)間為0、4、8和24 h，后續(xù)正式試驗(yàn)處理時(shí)間為24 h。

處理結(jié)束后，更換含有CCK-8溶液的DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM∶CCK-8溶液=9∶1)，CO2恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm吸光度(OD)讀數(shù)。

1.3.2 細(xì)胞增殖

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液接種在24孔板中，密度為2.5×105個(gè)/孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后，采用BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞增殖情況，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 總ROS含量

采用ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定總ROS含量。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液接種在96孔板(黑色透明底)中，密度為2×104個(gè)/孔，邊緣孔加入等體積的PBS，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)。處理結(jié)束后加入無血清DMEM稀釋2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，充分去除游離的DCFH-DA，多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.3.4 線粒體膜電位

利用熒光探針JC-1檢測(cè)AAPH對(duì)線粒體膜電位的影響。用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h后，DMEM洗滌細(xì)胞1次，加入JC-1探針(終濃度為5 μmol/L)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20～30 min。孵育結(jié)束后用DMEM洗滌細(xì)胞2次，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液接種在48孔板中，密度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)。利用基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)胞總DNA，熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)。本試驗(yàn)分別選取mtDNA編碼的基因細(xì)胞色素C氧化酶亞基1(COX1)、ATP合酶亞基6(ATPase6)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基2(ND2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基3(ND3)用于定量分析，以保守的單拷貝核基因胰高血糖素(GCG)作為內(nèi)參基因，定量細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)。相關(guān)基因引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.3.6 線粒體功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞懸液接種在12孔板中，密度為5×105個(gè)/孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換新鮮的用含有不同濃度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的細(xì)胞培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞提取RNA，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

根據(jù)Trizol試劑(美國Invitrogen公司)說明書抽提細(xì)胞總RNA，NanoDrop測(cè)定RNA濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit(美國Invitrogen公司)說明書合成cDNA模板。利用熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因[線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1(TFB1M)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子B2(TFB2M)、解耦連蛋白1(UCP1)、解耦連蛋白2(UCP2)、解耦連蛋白3(UCP3)]mRNA的表達(dá)情況，根據(jù)geNorm分析方法從β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、β2微球蛋白(B2M)、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)、核糖體蛋白L4(RPL4)和TATA結(jié)合蛋白(TBP)中選擇最為適當(dāng)?shù)?個(gè)基因作為本項(xiàng)目中定量結(jié)果分析的內(nèi)參基因。相關(guān)基因引物序列見表1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力的影響

由圖1-A可以看出，與對(duì)照組(0 mmol/L AAPH處理)相比，當(dāng)處理時(shí)間為4和8 h時(shí)，較低濃度(30、50、100 mmol/L)的AAPH處理對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力沒有顯著影響(P>0.05)；200 mmol/L AAPH處理8 h顯著降低IPEC-J2細(xì)胞活力(P<0.05)；400 mmol/L AAPH處理4和8 h均顯著降低IPEC-J2細(xì)胞活力(P<0.05)；當(dāng)處理時(shí)間為24 h時(shí)，不同濃度(30、50、100、200、400 mmol/L)的AAPH處理均顯著降低IPEC-J2細(xì)胞活力(P<0.05)。

由圖1-B可以看出，與對(duì)照組相比，26 mmol/L AAPH處理24 h時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)；28 mmol/L AAPH處理24 h時(shí)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活力沒有顯著影響(P>0.05；30 mmol/L AAPH處理24 h時(shí)，IPEC-J2細(xì)胞活力在40%～70%，顯著降低(P<0.05)；32、34、36和38 mmol/L AAPH處理24 h時(shí)，細(xì)胞活力均低于50%，顯著降低(P<0.05)。因此，后續(xù)研究中AAPH的處理時(shí)間為24 h，處理濃度為0、30、32和34 mmol/L。由以上結(jié)果可知，低濃度AAPH和(或)短時(shí)間處理，IPEC-J2細(xì)胞活力不受影響或一定程度上增加；而當(dāng)AAPH濃度超過一定濃度閾值后，IPEC-J2細(xì)胞活力呈現(xiàn)劑量依賴性下降趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比均顯著降低。

***表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響

由圖2-A可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細(xì)胞后，視野內(nèi)增殖細(xì)胞[5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)染色]數(shù)量明顯減少。由圖2-B可以看出，在6個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域中計(jì)算細(xì)胞增殖的數(shù)量，不同濃度的AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞增殖(P<0.05)。

圖2 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響

2.3 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞線粒體功能的影響

不同濃度AAPH處理IPEC-J2細(xì)胞后，JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位的變化，紅色熒光的喪失和胞質(zhì)中綠色熒光的增加表示線粒體膜電位的破壞。由圖3-A可以看出，未經(jīng)處理的IPEC-J2細(xì)胞顯示線粒體極化良好，顯示為紅色熒光點(diǎn)狀染色，而用不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細(xì)胞染色逐漸被擴(kuò)散綠色熒光取代，表明線粒體膜電位降低[21]。

A：線粒體膜電位；B：活性氧生成。

此外，由圖3-B可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細(xì)胞后，總ROS含量顯著增加(P<0.05)，且與AAPH濃度成正比。

2.4 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

試驗(yàn)選取了4個(gè)線粒體基因(COX1、ATPase6、ND2和ND3)，檢測(cè)不同濃度AAPH處理對(duì)IPEC-J2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的影響。由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，不同濃度AAPH處理后IPEC-J2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)均顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。

圖4 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

2.5 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

由圖5可以看出，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細(xì)胞后，顯著抑制了線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM、TFB1M和TFB2M的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，其中TFB1M的mRNA表達(dá)水平下降趨勢(shì)較小。此外，不同濃度AAPH處理IPEC-J2細(xì)胞后，顯著抑制了UCP1和UCP3的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，而對(duì)UCP2的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)。

圖5 不同濃度AAPH對(duì)IPEC-J2細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

腸上皮是一個(gè)多細(xì)胞界面，是腸道微環(huán)境和黏膜免疫系統(tǒng)之間的屏障，同時(shí)支持營養(yǎng)素、水和廢物的矢量運(yùn)輸[22]。已有的研究表明，腸上皮功能受損與腸道和全身性許多疾病狀態(tài)相關(guān)，受損的上皮可能在特定的胃腸道疾病中具有致病作用[22]。在生理或病理過程中，腸上皮細(xì)胞最早感受和響應(yīng)外界刺激，在應(yīng)激狀態(tài)下最易受到氧化損傷[1-3]。腸上皮細(xì)胞具有獨(dú)特的代謝特性，這由線粒體活性的變化反映出來。線粒體功能已成為決定細(xì)胞命運(yùn)以及協(xié)調(diào)細(xì)胞代謝、免疫力、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，線粒體功能的改變與炎性腸病、結(jié)直腸癌等疾病的生理和病理過程密切相關(guān)[23]。因此，本研究采用自由基引發(fā)劑AAPH刺激IPEC-J2細(xì)胞，檢測(cè)線粒體功能相關(guān)指標(biāo)變化，建立腸上皮細(xì)胞氧化損傷模型。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度(30、32、34 mmol/L)AAPH長時(shí)間刺激導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞活力顯著下降。值得注意的是，低濃度AAPH和(或)短時(shí)間刺激在一定程度上提高了細(xì)胞活力，這一現(xiàn)象可能與ROS在細(xì)胞命運(yùn)中的雙重作用有關(guān)。已有的證據(jù)表明，短暫、低濃度的ROS爆發(fā)在生理上是有益的，而持續(xù)的高ROS含量則與病理進(jìn)程有關(guān)[24]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞增殖的影響，試驗(yàn)通過熒光標(biāo)記物EdU檢測(cè)了細(xì)胞增殖的情況，結(jié)果表明不同濃度AAPH處理均顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞增殖。

線粒體作為ROS產(chǎn)生的主要場所，極易受到壓力和應(yīng)激引起的氧化損傷，線粒體應(yīng)激導(dǎo)致線粒體ROS(mROS)產(chǎn)生改變或線粒體膜電位喪失，從而引起不同的應(yīng)激信號(hào)[24]。研究表明，細(xì)胞暴露在應(yīng)激或風(fēng)險(xiǎn)因子(低氧、高糖、高膽固醇、感染、化學(xué)致癌物、電離輻射等)中會(huì)引起線粒體膜電位崩潰，導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過量的ROS[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度AAPH處理的IPEC-J2細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞中總ROS含量顯著增加。類似的，在人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)中，AAPH處理顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量，降低線粒體膜電位[15,27]。

在許多損害呼吸鏈的病理?xiàng)l件下，mROS的產(chǎn)生顯著增強(qiáng)，mtDNA位于呼吸鏈附近，對(duì)氧化損傷的敏感性高于核DNA(nDNA)，因而它比nDNA受到的氧化損傷更大[28]。在持續(xù)的氧化應(yīng)激條件下，可能最終導(dǎo)致mtDNA耗竭，因此mtDNA是線粒體功能障礙的生物標(biāo)記之一[29-30]。本研究的結(jié)果也表明，不同濃度AAPH處理均導(dǎo)致IPEC-J2細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。有趣的是，癌細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)的變化是異常調(diào)節(jié)的，與氧化應(yīng)激增加有關(guān)，但可能顯示增加或減少，具體取決于癌癥類型、組織和疾病階段[29]。

線粒體的含量對(duì)細(xì)胞功能至關(guān)重要，取決于線粒體生物發(fā)生與線粒體之間的平衡，在細(xì)胞中受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)[26]。新的線粒體形成受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括TFAM和線粒體轉(zhuǎn)錄因子B(TFBMs)[26]。TFAM轉(zhuǎn)錄的上調(diào)通常與mtDNA拷貝數(shù)的增加同時(shí)出現(xiàn)，這表明TFAM將核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與mtDNA拷貝數(shù)聯(lián)系起來，從而協(xié)調(diào)了2個(gè)基因組之間的線粒體生物發(fā)生[31]。類似地，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，不同濃度AAPH處理均顯著抑制TFAM和TFBMs的表達(dá)，與此同時(shí)mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。

此外，線粒體定位蛋白家族中的解偶聯(lián)蛋白(UCPs)參與ROS產(chǎn)生的控制，UCPs通常會(huì)限制mROS的產(chǎn)生進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[26]。在內(nèi)皮細(xì)胞(EC)中，UCP1過表達(dá)抑制mROS的產(chǎn)生，并且人主動(dòng)脈EC中UCP2的過表達(dá)阻斷了脂肪酸誘導(dǎo)的mROS的產(chǎn)生[32-33]。UCP2上調(diào)也可改善高血糖引起的內(nèi)皮功能障礙[26,34]。Cadenas等[35]發(fā)現(xiàn)，心臟中表達(dá)的UCP1同源物UCP2和UCP3通過減少ROS的產(chǎn)生來保護(hù)線粒體的氧化損傷。肌細(xì)胞中適度的UCP3過表達(dá)抑制了ROS的產(chǎn)生并增加了脂肪酸的氧化[36]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AAPH處理顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞中UCP1和UCP3的表達(dá)，對(duì)UCP2的表達(dá)沒有顯著影響。值得注意的是，與UCP1和UCP3不同，UCP2在AAPH誘導(dǎo)下的表達(dá)水平略有上升。此前也有報(bào)道顯示患有慢性高血糖癥的病人中UCP2的表達(dá)增加以及UCP3的表達(dá)減少可能會(huì)導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌受損，表明UCP2和UCP3在調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能中可能具有不同的作用[37]。這些結(jié)果提示我們UCP2在腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激響應(yīng)中可能具有不同的調(diào)控機(jī)制和作用。

本研究揭示了ROS介導(dǎo)的線粒體應(yīng)激可能是IPEC-J2細(xì)胞響應(yīng)氧化損傷的潛在機(jī)制之一(圖6)。通過一系列試驗(yàn)評(píng)估IPEC-J2細(xì)胞氧化損傷，建立了AAPH誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，為進(jìn)一步深入研究氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物腸道健康影響提供了方便且穩(wěn)定的體外模型，為開發(fā)安全、高效的飼用抗氧化劑提供了潛在的作用靶點(diǎn)。

AAPH：2，2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽 2,2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride；ROS：活性氧 reactive oxygen species；mROS：線粒體活性氧 mitochondrion reactive oxygen species；mtDNA：線粒體DNA mitochondrion DNA；ΔΨm：線粒體膜電位 mitochondrial membrane potential；TFAM：線粒體轉(zhuǎn)錄因子A mitochondrial transcription factor A：TFBMs：線粒體轉(zhuǎn)錄因子B mitochondrial transcription factor B；UCP1/3：解偶聯(lián)蛋白 uncoupling protein 1/3?！荷仙?increase；↓：下降 decrease。

4 結(jié) 論

① 在AAPH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，IPEC-J2細(xì)胞活力下降，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，細(xì)胞線粒體膜電位降低，mtDNA拷貝數(shù)降低，線粒體生物合成相關(guān)基因表達(dá)受到抑制。

② 綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)，可采用30 mmol/L AAPH刺激IPEC-J2細(xì)胞24 h建立豬腸上皮細(xì)胞氧化損傷模型。