脂肪酶的作用機(jī)理及分泌調(diào)節(jié)研究進(jìn)展

閆昭明 劉霜莉 黃華山 陳清華*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.山東隆科特酶制劑有限公司，臨沂 276400)

畜牧業(yè)中抗生素的不規(guī)范使用，導(dǎo)致了病原微生物對(duì)抗生素的耐藥性及畜產(chǎn)品中抗生素殘留等問題。自2020年起，我國施行飼料端全面“禁抗”新舉措。因此尋找良好的抗生素替代物將是目前的熱點(diǎn)研究工作。其中，飼用酶制劑在實(shí)際生產(chǎn)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。飼用不同種類酶制劑有助于提高動(dòng)物對(duì)飼糧的養(yǎng)分消化率[1]，從另一個(gè)角度也側(cè)面反映了飼糧營養(yǎng)價(jià)值的提高[2]。飼用酶制劑有助于加速消化道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的降解，并降低抗?fàn)I養(yǎng)因子所帶來的負(fù)面影響，降低食糜黏度同時(shí)促進(jìn)谷物飼糧中非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSP)的消化并產(chǎn)生低聚糖，進(jìn)而影響腸道內(nèi)微生物的數(shù)量及組成[3]。動(dòng)物內(nèi)源可分泌三大類消化酶，分別為蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。其中蛋白酶和淀粉酶的研究較為完整和深入，但對(duì)于脂肪酶尤其是對(duì)于其分泌及消化的機(jī)制性研究還需要進(jìn)一步完善。本文就脂肪酶的分類、作用機(jī)理、分泌調(diào)節(jié)進(jìn)行綜述，以期為脂肪酶的應(yīng)用提供參考。

1 脂肪酶的種類及作用機(jī)理

脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)共同構(gòu)成機(jī)體的產(chǎn)熱供能體系，也被稱為健康所必需的“三大營養(yǎng)素”[4]，分別具有獨(dú)特的生理功能，同時(shí)是動(dòng)物維持正常生命活動(dòng)的根本保證。脂質(zhì)除是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的能量來源外，還是質(zhì)膜及細(xì)胞膜的重要組成部分，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的過程中發(fā)揮介質(zhì)的作用[5]。甘油三酯(triglyceride，TG)是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂類物質(zhì)的重要組成成分，主要儲(chǔ)存于脂肪組織中[6]。動(dòng)物機(jī)體對(duì)于能量的攝入和消耗之間的平衡關(guān)系在一定程度上決定了生物體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。當(dāng)能量攝入量大于消耗量時(shí)，未能被消耗的能量將會(huì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)，并通過發(fā)生酯化反應(yīng)生產(chǎn)TG儲(chǔ)存于體內(nèi)。而當(dāng)能量消耗量較大時(shí)，TG也可發(fā)生脂解反應(yīng)再次將FA釋放出來[7]。

脂肪酶又稱三?；视王；饷?，是酯酶的一個(gè)分類，具有水解TG使之生成甘油和FA的能力。脂肪酶在自然界中來源廣泛，動(dòng)物、植物及微生物均具有生產(chǎn)脂肪酶的能力，其中動(dòng)物脂肪酶多存在于消化道及胰腺等器官中[8]。大多數(shù)種類脂肪酶的最適存活溫度在30～50 ℃，且適宜偏堿性的外部pH環(huán)境，活性也受金屬離子及有機(jī)溶劑的影響[9]。目前，對(duì)脂肪酶的研究主要集中于脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)、單酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MGL)，這3種酶在機(jī)體內(nèi)脂肪及非脂肪組織中對(duì)脂質(zhì)代謝及分解具有明確的功能[10]。在TG的水解過程中，這3種酶表現(xiàn)出“順序”催化的功能。即ATGL首先將TG水解為二酰甘油(diacylglycerol，DAG)和1分子FA；再由HSL繼續(xù)催化，將DAG轉(zhuǎn)化為單酰甘油(monoacylglycerol，MAG)和1分子FA；最后由MGL發(fā)揮催化作用，將MAG分解為甘油和FA[11]；為保證機(jī)體內(nèi)水解平衡性，DAG和MAG還可通過二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)和單?；视王；D(zhuǎn)移酶(monoacyglycerol acyltransferases，MGAT)發(fā)生酯化過程再次生成TAG[12]，具體過程如圖1所示。

TG：甘油三酯 triglyceride；DAG：二酰甘油 diacylglycerol；MAG：?jiǎn)熙８视?monoacylglycerol；FA：脂肪酸 fatty acid；Glycerol：甘油；ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase；HSL：激素敏感脂肪酶 hormone-sensitive lipase；MGL：?jiǎn)熙８视椭久?monoacylglycerol lipase；DGAT：二?；视王；D(zhuǎn)移酶 diacylglycerol acyltransferase；MGAT：?jiǎn)熙；视王；D(zhuǎn)移酶 monoacyglycerol acyltransferases。

1.1 ATGL

在2004年首次發(fā)現(xiàn)Patatin-like磷脂酶的結(jié)構(gòu)域2(PNPLA2)，為簡(jiǎn)化其描述，也稱為ATGL[13]。其主要功能為開始TG的水解過程，作為限速酶控制TG的水解速度[14]，并被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)脂滴與脂質(zhì)周轉(zhuǎn)過程中重要的水解酶[15]。通過ATGL免疫熒光發(fā)現(xiàn)其主要定位區(qū)域?yàn)榧?xì)胞脂滴表面，說明其本質(zhì)是一種脂滴蛋白[16]。

G0/G1開關(guān)基因2(G0/G1 switch gene 2，G0S2)與比較基因識(shí)別-58(comparative gene identification-58，CGI-58)這2種調(diào)節(jié)蛋白共同參與動(dòng)物機(jī)體內(nèi)ATGL的活化[17]。G0S2是一種重要的蛋白質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期由G0期向G1期發(fā)生轉(zhuǎn)變，進(jìn)而表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖活動(dòng)的調(diào)控作用。同時(shí)其可作為一種內(nèi)源選擇性抑制劑抑制ATGL活性[18]，其機(jī)制可描述為G0S2的疏水結(jié)構(gòu)區(qū)與ATGL中Patatin結(jié)構(gòu)域以非競(jìng)爭(zhēng)方式結(jié)合[19]，形成ATGL-G0S2復(fù)合體，從而減少TG的分解。CGI-58是ATGL發(fā)揮水解TG功能的輔助激活因子[20]，其本身不具有水解酶活性。在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CGI-58數(shù)量的增加可提高TG水解酶的活性，但將ATGL基因敲除后卻未表現(xiàn)出類似效果，說明CGI-58是通過特異性激活A(yù)TGL進(jìn)而促進(jìn)TG的水解，且CGI-58的數(shù)量也決定了ATGL的活性上限[21]。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma，PPAR-γ)在脂肪生成和脂肪組織發(fā)育的過程中是一種關(guān)鍵的調(diào)控因子。在ATGL水解TG的過程中，所產(chǎn)生的脂肪酸可作為信號(hào)分子調(diào)控由PPAR-γ介導(dǎo)的酯化耦聯(lián)反應(yīng)，以達(dá)到防止在脂質(zhì)水解過程中出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及TG的過量水解，維持脂肪細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能完整性[16]。此外，G0S2是PPAR-γ的靶基因，因其啟動(dòng)子區(qū)域包括PPAR-反應(yīng)元件(PPAR-response element，PPRE)，PPAR-γ與PPRE發(fā)生特異性結(jié)合以上調(diào)G0S2基因的表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)ATGL活性產(chǎn)生影響。G0S2在人和小鼠脂肪細(xì)胞形成過程中表達(dá)量顯著上調(diào)，提示G0S2在負(fù)調(diào)控ATGL活性的同時(shí)也參與了機(jī)體內(nèi)脂肪形成[22]。

1.2 HSL

HSL在機(jī)體內(nèi)脂肪動(dòng)員(TG的逐步水解，其產(chǎn)物經(jīng)血液運(yùn)輸至不同組織被氧化利用的過程)的過程中發(fā)揮作用，即調(diào)動(dòng)儲(chǔ)存的脂肪用于氧化供能[23]。其作為一種中性脂肪酶，對(duì)底物具有特異性的催化作用，主要分布于脂肪組織中，在肌肉及腎上腺、睪丸、胰腺等組織中也有少量表達(dá)[24]。多種抗脂解激素如胰島素、前列腺素，脂解激素如胰高血糖素、腎上腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素、促甲狀腺激素，可作用于HSL并發(fā)生磷酸化或去磷酸化反應(yīng)從而調(diào)控其活性，其具有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，位點(diǎn)1(調(diào)節(jié)位點(diǎn))可被蛋白激酶A(protein kinase，PKA)和糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSKS)磷酸化，外源應(yīng)用胰島素可通過腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依賴的方式活化環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)磷酸二酯酶，以加速cAMP水解的形式抑制PKA活性，從而降低HSL活性[25]。近年來研究表明，白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)可通過增加cAMP數(shù)量，增強(qiáng)PKA的活性，使HSL的絲氨酸563及660位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，以提高HSL活性，磷酸化HSL(p-HSL)可由細(xì)胞基質(zhì)向脂滴表面發(fā)生轉(zhuǎn)移同時(shí)表現(xiàn)出解脂的功能[26]。位點(diǎn)2(基礎(chǔ)位點(diǎn))磷酸化受AMP-活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium-CaM-dependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)共同調(diào)控[27]。

1.3 MGL

MGL屬于絲氨酸水解酶家族，是TG實(shí)現(xiàn)完全水解過程中的一種關(guān)鍵酶，也是MAG降解的限速酶[28]。在組織水平上，MGL主要存在于大腦、心臟、脂肪組織、腎臟、睪丸、卵巢等中并表現(xiàn)出特異性；在細(xì)胞層面上，MGL主要存在于細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜及脂滴中[29]。對(duì)其底物選擇性的研究發(fā)現(xiàn)，相較于飽和脂肪酸形式的底物，MGL對(duì)不飽和脂肪酸形式的底物的水解活性較強(qiáng)，底物脂肪酸的不飽和程度對(duì)于MGL活性也有顯著影響，MGL對(duì)于花生四烯甘油的水解效率高于棕櫚酰甘油[30]。

MGL可將內(nèi)源性大麻素(2-arachidonylglycerol，2-AG)水解為花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，AA作為一種二十烷酸衍生物的活性物質(zhì)，具有豐富的生理功能，目前MGL-(2-AG)-AA水解代謝途徑已逐步成為研究熱點(diǎn)[31]。也有研究表明，MGL與多種病理及生理過程的發(fā)生有關(guān)，癌癥細(xì)胞中MGL水解TG的過程中誘導(dǎo)如溶血磷脂酸、前列腺素、溶血磷脂及溶血磷脂乙醇胺等信號(hào)分子的表達(dá)，其中溶血磷脂酸及前列腺素等可誘發(fā)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[32]，提高生殖系統(tǒng)癌癥、黑色素瘤的發(fā)生率及轉(zhuǎn)移性，同時(shí)影響腸道功能的正常表達(dá)[33]。有研究表明，敲除MGL基因可通過抑制肝臟中關(guān)鍵的脂肪生成酶，如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)、PPAR-γ2、二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶-1(diacylgycerol acyhransferase-DGAT-1)的表達(dá)，從而促進(jìn)FA氧化并防止小鼠肝臟脂肪變性的發(fā)生，但小鼠性腺中白色脂肪生成量增加，并未對(duì)脂肪分解產(chǎn)生影響[34]。

2 脂肪酶的分泌調(diào)節(jié)

動(dòng)物消化道內(nèi)主要包括舌脂肪酶、胃脂肪酶和胰脂肪酶3種，胃脂肪酶在脂質(zhì)水解的過程中發(fā)揮輔助作用，并對(duì)胰脂肪酶的分泌起調(diào)控作用[35]。就分泌部位而言，舌脂肪酶及胃脂肪酶也可統(tǒng)稱為十二指腸前脂肪酶，胰脂肪酶稱為十二指腸內(nèi)脂肪酶。由胰腺分泌的胰脂肪酶可直接影響小腸對(duì)于FA的吸收，故被認(rèn)為是最重要的內(nèi)源脂肪酶[9]。同時(shí)，胰脂肪酶分泌能力的強(qiáng)弱是衡量動(dòng)物對(duì)脂肪消化能力高低的重要指標(biāo)[36]。由肝細(xì)胞分泌產(chǎn)生的含有膽汁酸、甘油膽酸等成分的膽汁可對(duì)脂肪進(jìn)行乳化，從而起到輔助脂肪酶消化的作用。

影響脂肪酶分泌的因素是多方面且復(fù)雜的。動(dòng)物不同生理階段及健康狀況下脂肪酶活性均有差別，母豬哺乳期對(duì)脂質(zhì)的利用效率最高[37]。畜禽均表現(xiàn)出“為能而食”的特點(diǎn)，添加油脂可提高豬飼糧能量水平。Liu等[38]通過應(yīng)用不同能量水平飼糧飼喂斷奶仔豬后發(fā)現(xiàn)，高能飼糧組仔豬十二指腸及空腸內(nèi)脂肪酶活性較高，提示飼糧能量水平與豬機(jī)體內(nèi)脂肪酶的分泌存在交互效應(yīng)。以上試驗(yàn)結(jié)果在肉雞能量攝入與脂肪酶分泌的研究中得到了驗(yàn)證[39]。此外，某些重金屬如銅元素可作為脂肪酶的激活劑，并通過抑制消化道內(nèi)有害菌生長(zhǎng)、繁殖而提高動(dòng)物腸道健康水平，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的利用[40]?？藭椎豙41]探究不同金屬離子在體外條件下對(duì)脂肪酶水解能力的影響，發(fā)現(xiàn)Sn2+、Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+均可促進(jìn)脂肪酶水解能力的提高，但Zn2+則會(huì)降低脂肪酶的活性。激素對(duì)脂肪酶的分泌調(diào)節(jié)研究較為深入，HSL被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)脂解過程中受激素調(diào)控的主要因子，但對(duì)豬ATGL基因激素敏感性的研究發(fā)現(xiàn)，ATGL在激素誘導(dǎo)的脂肪水解過程中也發(fā)揮了作用。相較于自由采食，在限飼條件下，豬機(jī)體內(nèi)胰島素水平較低，胰島素以負(fù)反饋調(diào)控形式促進(jìn)ATGL的產(chǎn)生[42]。同時(shí)，飼糧組成及加工工藝、環(huán)境因素等都會(huì)對(duì)脂肪酶的分泌和脂質(zhì)的消化吸收產(chǎn)生影響。

目前對(duì)于外源酶補(bǔ)充是否影響動(dòng)物內(nèi)源酶分泌的觀點(diǎn)主要分為2類：第1類即少量添加外源酶有提高機(jī)體消化酶水平的作用，但過量補(bǔ)充則抑制胰內(nèi)源酶的分泌；第2類則不支持“反饋性抑制”理論，原因在于外源補(bǔ)充酶多由細(xì)菌或真菌在體外發(fā)酵生產(chǎn)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與內(nèi)源酶存在區(qū)別[43]。為探究?jī)?nèi)、外源酶制劑是否存在交互分泌機(jī)制，應(yīng)先探究酶制劑分泌的方式。以胰脂肪酶為例，胰腺內(nèi)腺泡細(xì)胞核中基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄作用生成mRNA，并通過翻譯、修飾、包膜作用形成酶原顆粒，后經(jīng)高爾基體參與細(xì)胞分泌活動(dòng)，以胞吐形式將酶釋放至胰管中，并進(jìn)入十二指腸發(fā)揮酶解功能[44]。但目前，對(duì)于外源添加脂肪酶是否可以在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)控動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源脂肪酶的分泌還鮮有報(bào)道。

在畜禽的養(yǎng)殖實(shí)踐中，Liu等[38]在斷奶仔豬低能飼糧中添加150 mg/kg的脂肪酶后發(fā)現(xiàn)，其雖未能影響仔豬生長(zhǎng)性能，但可在提高養(yǎng)分表觀消化率的基礎(chǔ)上同時(shí)提高十二指腸及回腸的脂肪酶活性，并對(duì)腸道內(nèi)蛋白酶活性也有提高效應(yīng)。Chen等[45]在仔豬飼糧中添加200 mg/kg的未包被脂肪酶或包被脂肪酶后也得到了類似的結(jié)果，且包被脂肪酶的效果更佳。包被的主要功能是可進(jìn)一步保證酶的結(jié)構(gòu)完整及生理活性，將脂肪酶在特定部位進(jìn)行釋放，使之免受胃蛋白酶的消化從而降低損失[46]。Hu等[47]以肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，在低能飼糧中添加的脂肪酶也可促進(jìn)胰脂肪酶活性的提高，并達(dá)到提高飼料轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)性能的目的。幼齡動(dòng)物對(duì)脂質(zhì)的消化能力較弱，主要與消化系統(tǒng)未能完全發(fā)育有關(guān)。斷奶應(yīng)激是導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)受限的主要原因，這一階段仔豬的營養(yǎng)物質(zhì)來源從液體飼糧向固體飼糧過渡，仔豬脂肪酶、蛋白酶的分泌減少并引起腹瀉的發(fā)生[48]。動(dòng)物消化道脂肪酶活性隨著日齡不斷增加，對(duì)脂質(zhì)的利用效率得以提升[49]，主要原因是對(duì)于飼糧中飽和脂肪酸的消化率增加[50]。3周后，仔豬脂肪酶分泌量達(dá)到正常水平，故仔豬階段外源補(bǔ)充脂肪酶的有效期為仔豬斷奶后3周內(nèi)[51]。

3 小結(jié)與展望

脂肪酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用具有提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、緩解飼料資源短缺、利于環(huán)境保護(hù)等功能，在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用更表現(xiàn)出降低腹瀉率的效果[52]，是防治仔豬斷奶腹瀉的良好選擇之一。目前通過微生物發(fā)酵的手段生產(chǎn)脂肪酶的技術(shù)(液體深層發(fā)酵)已經(jīng)逐步成熟，也已實(shí)現(xiàn)對(duì)曲霉、假單胞酶、根霉等高效發(fā)酵菌種的篩選工作。但是脂肪酶多適宜在堿性環(huán)境下發(fā)揮生理功能，而動(dòng)物消化道內(nèi)主要為酸性環(huán)境。故還需通過發(fā)酵菌種改造、基因改良工程、發(fā)酵工程及后期工藝處理等方面進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

目前研究者已形成的共識(shí)是使用酶制劑對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)是有益的，伴隨單胃動(dòng)物的不斷生長(zhǎng)，酶制劑的功能從補(bǔ)充內(nèi)源缺乏[53]向通過微生物路徑介導(dǎo)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益作用[54]。但在不同動(dòng)物、不同生理階段中應(yīng)用不同酶制劑(單一或復(fù)合)所得到的結(jié)果并不統(tǒng)一，脂肪酶的應(yīng)用亦是如此。故對(duì)于脂肪酶的分泌、作用機(jī)制及在機(jī)體內(nèi)與激素、其他營養(yǎng)物質(zhì)之間的互作效應(yīng)還值得進(jìn)一步研究。