鯽魚(yú)與草魚(yú)的腸道微生物區(qū)系及主要消化酶活性研究

譚 愷，徐 燦

（上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

鯽魚(yú)（Carassius auratus）在我國(guó)擁有悠久的養(yǎng)殖歷史，是我國(guó)最常見(jiàn)的雜食性淡水魚(yú)類(lèi)之一，同時(shí)也是優(yōu)質(zhì)的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)和經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，具有適應(yīng)力強(qiáng)、繁殖能力高、抗病害能力好、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)[1]。草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）作為“四大家魚(yú)”之中草食性魚(yú)類(lèi)的典型代表，是全球淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的一個(gè)品種，在全國(guó)范圍內(nèi)分布廣泛，具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量高等顯著特點(diǎn)，但抗病害能力相對(duì)較差[2]。

胃腸道作為整個(gè)機(jī)體同外界最廣泛接觸的器官之一。它不僅承擔(dān)著消化吸收機(jī)體攝入的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，同時(shí)也是機(jī)體為了阻止腸道細(xì)菌移位而設(shè)立的一道重要防線。同大多數(shù)生物一樣，魚(yú)類(lèi)的腸道內(nèi)也棲居著大量的微生物。在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，這些微生物與宿主之間建立起了長(zhǎng)期且穩(wěn)定的共生關(guān)系，進(jìn)而直接影響著宿主的飲食習(xí)慣、身體機(jī)能等。除此之外，腸道內(nèi)的酶活性也在很大程度上影響著魚(yú)的各項(xiàng)生理功能，其活性更是直接決定了機(jī)體對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收程度[3]。草魚(yú)和鯽魚(yú)是市面上兩種主要的魚(yú)類(lèi)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位。研究魚(yú)腸道中微生物及酶活，能夠在養(yǎng)殖過(guò)程中為魚(yú)類(lèi)健康狀況提供具體評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)對(duì)魚(yú)病的防治及飼料的開(kāi)發(fā)提供重要的指導(dǎo)意義。

筆者選取同一人工養(yǎng)殖水域，生活環(huán)境完全一致的草魚(yú)和鯽魚(yú)進(jìn)行試驗(yàn)，探究鯽魚(yú)與草魚(yú)在腸道微生物區(qū)系和腸道主要消化酶活性的差異，進(jìn)一步分析其對(duì)于魚(yú)類(lèi)本身的飲食習(xí)慣和健康狀況的影響，以期為鯽魚(yú)和草魚(yú)的養(yǎng)殖與生活習(xí)性機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集于2019 年7 月21 日，在湖南省漣源市橋頭河鎮(zhèn)某村，選取無(wú)生活污水污染、未投放人工飼料，且多種魚(yú)類(lèi)混養(yǎng)的池塘。采集喂養(yǎng)時(shí)間和生活環(huán)境一致的草魚(yú)和鯽魚(yú)各5 尾，將活魚(yú)帶回湖南省長(zhǎng)沙市湖南中醫(yī)藥大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。草魚(yú)重（1 450±10）g/尾，鯽魚(yú)重（440±10）g/尾。

1.1.2 培養(yǎng)基腸道細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；真菌（霉菌與酵母菌）數(shù)的分析使用馬丁孟加拉紅鏈霉素瓊脂培養(yǎng)基；乳酸菌數(shù)量的測(cè)定使用MRS 瓊脂培養(yǎng)基；雙歧桿菌數(shù)量的分析用BBL瓊脂培養(yǎng)基。具體配方參考趙斌等[4]的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.1.3 試 劑熒光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate，又稱(chēng)3', 6'-二乙酰-熒光素，F(xiàn)DA）儲(chǔ)存液：2 mg FDA 和1 mL 丙酮，棕色瓶裝，-20 ℃避光保存；磷酸鹽緩沖液（pH 值7.6）：4.0 g NaCl、0.1 g KCl、0.27 g Na2HPO4、0.12 g KH2PO4溶于蒸餾水后定容至500 mL；DNS 液：稱(chēng)取酒石酸鉀鈉91 g 溶于500 mL 蒸餾水中，在溶液中依次加入3.15 g 3,5-二硝基水楊酸和20 g NaOH，加熱攪拌使其溶解，再加入2.5 g 苯酚，2.5 g 無(wú)水Na2SO3，攪拌使之溶解，冷卻后定容至1 L，貯于棕色瓶中，放置一周后使用；0.4 mol/L TCA；福林酚試劑；0.4 mol/L NaOH 溶液；0.4 mol/L Na2CO3溶液；西紅柿浸出液；肝提取液。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式大容量通用冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5810R）、高壓滅菌鍋（YAMATO SQ510C）、電子天平（JA2003、YP- B2002）、氣浴恒溫振蕩器（SHZ-82）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·BII·500-S）、電子恒溫水浴鍋（DZKW-4）、電熱恒溫水槽（SSW-420-2S）、可調(diào)式封閉電爐（FL-1）、純水儀（ELGA PC120COBPM1）、722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)、78-1 型磁力加熱攪拌器等。

1.3 方 法

1.3.1 魚(yú)腸道內(nèi)容物的提取將采集的草魚(yú)和鯽魚(yú)用丁香酚麻醉后稱(chēng)重、取樣，先用無(wú)菌棉花將體表水擦拭干凈，然后用沾有濃度為75%酒精的棉球擦拭魚(yú)體表面進(jìn)行消毒，隨后采用無(wú)菌操作的方式用解剖剪從魚(yú)體肛門(mén)沿腹部向上剪開(kāi)。待腹部完全剪開(kāi)后，用鑷子剝離出魚(yú)的消化道，同時(shí)用沾有75%酒精的棉球擦拭消化道外壁。此后，用剪刀分離出中腸，采集各組的腸道內(nèi)容物，并將同種魚(yú)類(lèi)的腸道內(nèi)容物進(jìn)行稱(chēng)重、混勻。以上操作具體參照汪明等[5]的方法、在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.3.2 魚(yú)腸道微生物數(shù)量的測(cè)定按組進(jìn)行無(wú)菌操作[6]，稱(chēng)取一定量的鯽魚(yú)和草魚(yú)腸道內(nèi)容物分別放入裝有25 粒左右玻璃珠和90 mL 無(wú)菌水的三角瓶中，分別編號(hào)為1、2，之后放入搖床中，轉(zhuǎn)速120 r/min振搖30 min，使微生物充分分散，待振蕩結(jié)束后，取出混合液，采用10 倍梯度稀釋法將菌液稀釋至10-6。待稀釋完畢后，選擇合適的稀釋度，采用稀釋涂布平板法進(jìn)行。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，真菌在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，乳酸菌和雙歧桿菌均在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，每一個(gè)稀釋度設(shè)置3 次重復(fù)，求其平均值，并據(jù)此計(jì)算出每克腸道內(nèi)容物中所含的菌數(shù)。

1.3.3 魚(yú)腸道酶活性的分析在無(wú)菌條件下，取出魚(yú)體內(nèi)的腸道內(nèi)容物、稱(chēng)重，隨后將腸道內(nèi)容物用無(wú)菌水稀釋后裝瓶，放置于溫度為40 ℃的水浴鍋中保溫30 min，以充分溶出腸道內(nèi)容物中所含的酶蛋白，待冷卻，放入轉(zhuǎn)速為2 000 r/min 的離心機(jī)中離心10 min后，取上清液，即為腸道酶液，備用。測(cè)試時(shí)，吸取腸道酶液，分別滴加到標(biāo)記為纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶的試管中，經(jīng)操作后測(cè)定上述4 種酶的活性，各設(shè)3 次重復(fù)。腸道纖維素酶活性、腸道淀粉酶活性以及腸道木聚糖酶活性的測(cè)定均采用DNS比色法進(jìn)行，纖維素酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在46 ℃作用30 min 生成1 μg 還原糖定義為一個(gè)酶活單位（U），淀粉酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在37 ℃作用60 min生成1 μg還原糖定義為一個(gè)酶活單位（U），木聚糖酶活以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在46 ℃作用60 min 生成1 μg 還原糖定義為一個(gè)酶活單位（U）；蛋白酶活性的測(cè)定采用福林-酚法進(jìn)行，以1 g 腸道內(nèi)容物中的酶在37 ℃作用40 min 生成1 μg 氨基酸定義為一個(gè)酶活單位（U）[6]。

1.3.4 魚(yú)腸道微生物活度測(cè)定利用1.3.3 提取的腸道酶液，根據(jù)微生物活度的內(nèi)涵，具體流程參照Schnürer J 和Rosswall T[7]的方法進(jìn)行：取0.1 mL 濃度為2 mg/mL 的FDA 儲(chǔ)存液加入到19.9 mL 磷酸鹽緩沖液中，獲得濃度為10 μg/mL 的A 液，向 A 液中加入0.2 mL 腸道內(nèi)容物酶提取液，得到混合液，然后將混合液放入24 ℃的氣浴恒溫振蕩器中，振蕩培養(yǎng)90 min 后取出，并加入等體積的丙酮以終止反應(yīng)。經(jīng)3 μm 濾紙過(guò)濾，放入6 000 r/min 離心機(jī)中離心5 min 后重新取出，在490 nm 測(cè)定OD 值，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3 次，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 21.00 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各分組所得數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較若符合正態(tài)性、方差齊性則用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示有顯著性差異，P＜0.01 表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚(yú)和草魚(yú)的腸道微生物區(qū)系結(jié)果

微生物區(qū)系是特定環(huán)境中微生物的數(shù)量與種類(lèi)的組成。由表1 可見(jiàn)，鯽魚(yú)和草魚(yú)腸道內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)較接近，其中草魚(yú)腸道內(nèi)的真菌與雙歧桿菌數(shù)目均高于鯽魚(yú)，鯽魚(yú)腸道內(nèi)的乳酸菌數(shù)目高于草魚(yú)，但草魚(yú)腸道的各微生物數(shù)目與鯽魚(yú)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t細(xì)菌= -0.506，P細(xì)菌= 0.639；t真菌= -2.217，P真菌= 0.091；t乳酸菌= 3.692，P乳酸菌= 0.639；t雙歧桿菌=-0.420，P雙歧桿菌=0.696）。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，真菌菌落結(jié)構(gòu)顯示鯽魚(yú)和草魚(yú)的腸道真菌以青霉和曲霉等霉菌為主，幾乎沒(méi)有酵母菌（見(jiàn)圖1），而小鼠腸道中含有比較多的酵母菌[8]。

圖1 兩種魚(yú)類(lèi)的腸道真菌菌落

表1 兩種魚(yú)類(lèi)的腸道微生物區(qū)系結(jié)果

2.2 鯽魚(yú)和草魚(yú)的腸道主要消化酶活性特點(diǎn)

生物體的物質(zhì)轉(zhuǎn)化離不開(kāi)酶的參與，從腸道消化酶的活性能直接反映機(jī)體消化能力以及間接反映腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性。由表2可見(jiàn)，鯽魚(yú)腸道內(nèi)的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶活性均高于草魚(yú)。除草魚(yú)腸道內(nèi)的淀粉酶與鯽魚(yú)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（W淀粉酶= 47，P淀粉酶= 0.905 8），草魚(yú)腸道內(nèi)的蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶與鯽魚(yú)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存在極顯著差異（W蛋白酶= 21，P蛋白酶= 0.003 7；W纖維素酶=45，P纖維素酶= 0.000 3；W木聚糖酶= 45，P木聚糖酶= 0.000 3）。

2.3 鯽魚(yú)和草魚(yú)的腸道微生物活度

腸道微生物活度是腸道各類(lèi)水解酶活性的總和，能夠反映腸道對(duì)物質(zhì)的水解情況。由表2 可見(jiàn)，草魚(yú)腸道內(nèi)的微生物活度明顯低于鯽魚(yú)腸道內(nèi)的微生物活度，與鯽魚(yú)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且差異極顯著（WFDA= 45，PFDA= 0.000 3）。

表2 兩種魚(yú)類(lèi)的腸道主要消化酶活性及腸道微生物活度

3 討 論

3.1 鯽魚(yú)和草魚(yú)的腸道微生物區(qū)系特點(diǎn)

傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法能夠?qū)μ囟ǖ目膳囵B(yǎng)微生物進(jìn)行檢測(cè)，在腸道微生物數(shù)量的測(cè)定中也具有重要的意義[9-10]。隨著腸道微生物研究的深入，有關(guān)腸道微生物的應(yīng)用必將關(guān)注可培養(yǎng)微生物。此研究發(fā)現(xiàn)草魚(yú)腸道內(nèi)霉菌數(shù)量明顯高于鯽魚(yú)腸道內(nèi)霉菌數(shù)量，而乳酸菌數(shù)量卻明顯低于鯽魚(yú)，這一發(fā)現(xiàn)與吳杰奇等[11]的研究結(jié)果一致。乳酸菌是動(dòng)物腸道內(nèi)已知的益生菌，具有抑制病原菌的黏附、定植和入侵的作用，在腸道免疫方面發(fā)揮著重要的作用[3]，鯽魚(yú)腸道中乳酸菌的數(shù)量明顯高于草魚(yú)，這在一定程度上可解釋鯽魚(yú)抵抗能力強(qiáng)于草魚(yú)。草魚(yú)腸道中真菌數(shù)量較多可能與其攝入的食物種類(lèi)有關(guān)，自然環(huán)境下，草葉、樹(shù)葉等真菌含量較高，為草魚(yú)腸道貢獻(xiàn)了部分外源性真菌。有研究學(xué)者采用18S ITS 高通量測(cè)序的方法研究用構(gòu)樹(shù)葉投喂草魚(yú)腸道真菌群落多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，構(gòu)樹(shù)葉組和配合飼料組腸道真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯差異[12]。

腸道菌群種類(lèi)繁多，數(shù)量龐大。培養(yǎng)技術(shù)對(duì)腸道中有益微生物的產(chǎn)品研發(fā)提供了重要參考，為其分離和培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。此研究使用的是可培養(yǎng)腸道微生物指標(biāo)，但4 種可培養(yǎng)微生物的數(shù)目在兩種魚(yú)中差異并不顯著，說(shuō)明兩種魚(yú)在魚(yú)病方面的差異很可能與其他的少數(shù)幾種微生物有關(guān)[13-15]。因此，借助微生物培養(yǎng)技術(shù)只能粗略反映特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的腸道微生物特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采用高通量測(cè)序技術(shù)能更全面、更客觀地了解草魚(yú)和鯽魚(yú)腸道微生物特征[16]。

3.2 鯽魚(yú)和草魚(yú)腸道酶活性與食性的關(guān)系

腸道消化酶在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，機(jī)體免疫等方面發(fā)揮著重要作用，根據(jù)來(lái)源分為內(nèi)源性消化酶和外源性消化酶。腸道微生物與消化酶有著重要的聯(lián)系，飼料中添加益生菌能夠提高魚(yú)類(lèi)的消化酶活性，使一些難消化的大分子物質(zhì)分解成易被腸道細(xì)胞吸收的小分子物質(zhì)，進(jìn)而利于魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)[17]。一般而言，草食性魚(yú)類(lèi)含有相對(duì)較高的纖維素酶活性和淀粉酶活性，雜食性魚(yú)類(lèi)含有相對(duì)較高的蛋白酶活性和脂肪酶活性[18-19]。試驗(yàn)結(jié)果顯示鯽魚(yú)的蛋白酶顯著高于草魚(yú)，與之前的一些研究結(jié)果相吻合。但草魚(yú)的淀粉酶和纖維素酶卻低于鯽魚(yú)，這一發(fā)現(xiàn)與一些研究結(jié)果相反。這可能與飼養(yǎng)環(huán)境、年齡等因素有關(guān)。例如在魚(yú)體生長(zhǎng)后期，鯽魚(yú)和草魚(yú)的成魚(yú)均以植物性食料作為主要進(jìn)食對(duì)象，故在一定程度上存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[20]。此外，微生物活度的測(cè)定結(jié)果也與腸道酶活性的比較結(jié)果表現(xiàn)出一致性，猜測(cè)鯽魚(yú)在相同條件下迅速生長(zhǎng)發(fā)育成成魚(yú)，即要求腸道內(nèi)的多種水解酶具有較強(qiáng)的活性，從而提高魚(yú)體對(duì)于飼料的利用率，以得到更多的水解產(chǎn)物，進(jìn)而滿足自身對(duì)于生長(zhǎng)繁殖所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。腸道微生物與酶活性的關(guān)聯(lián)研究，對(duì)相關(guān)腸道調(diào)節(jié)劑的研發(fā)和使用具有較好的參考價(jià)值[21]。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，鯽魚(yú)和草魚(yú)在腸道微生物及酶活性方面存在一定的差異，草食性為主的魚(yú)腸道內(nèi)真菌數(shù)目高于雜食性魚(yú)，而乳酸菌數(shù)目低于雜食性魚(yú)，雜食性魚(yú)腸道內(nèi)多種酶活性高于草食性魚(yú)。