新疆雙峰駝乳酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的酶法制備和抑制特性

劉 宸，王學(xué)清，豆智華，王 俊，李榮蓉，徐趙玉，楊 潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)血壓的一種關(guān)鍵酶[1]，它是一種膜結(jié)合外在金屬蛋白酶，主要存在于肺組織、外周血管組織和血管內(nèi)皮細胞及其他種類的細胞中[2]。ACE可以使無活性的血管緊張素Ⅰ的C末端水解2 個氨基酸后轉(zhuǎn)變成有活性的血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ可以降低血液流速，減少腎臟水分和鹽的分泌，導(dǎo)致血管平滑肌收縮，引發(fā)高血壓，同時ACE可水解血管舒緩激肽，使其失活，而血管舒緩激肽可以舒張血管，使血壓降低，當(dāng)舒緩激肽受到抑制而血管緊張素Ⅱ的活性增加后，就會引發(fā)高血壓[3]。因此，以ACE為靶點的藥物研究引起了越來越多的關(guān)注，ACE已被證明在降低高血壓方面是成功的[4-5]。自1977年根據(jù)ACE底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)推測出ACE活性部位的模型并據(jù)此開發(fā)設(shè)計了第1個化學(xué)合成的ACE抑制劑卡托普利（Captopril）以來，ACE抑制劑藥物在高血壓治療中的作用得到了醫(yī)學(xué)界的普遍認可，但其對腎臟的毒副作用使研究者開始尋找安全性更高的ACE抑制劑[6]。天然來源的ACE抑制肽具有安全性高、毒副作用小、易吸收等特點，有著合成化學(xué)藥物不可比擬的優(yōu)越性，成為抗高血壓藥物研究的熱點之一，其中食品來源的ACE抑制劑更是研究熱點[7]。生物活性肽是食物蛋白質(zhì)的特殊片段，對人體健康具有一定的生理功能，它們存在于完整的食物蛋白質(zhì)中，可在食品加工過程中釋放，如發(fā)酵、體外或體內(nèi)酶水解[8-9]。

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，世界上約有2 900 萬峰駱駝[10]。而新疆駱駝?wù)急葹槿珖孜?，主要為準噶爾雙峰駝，泌乳期長達12～14 個月，全疆雙峰駝乳的年產(chǎn)量可達到3.2 萬t[11]。由于駝乳含有豐富的生物活性肽和保護酶，其對氧化損傷、腸胃疾病、肝炎和糖尿病都具有良好的治療作用[12]。同時由于駝乳中含有豐富的α-乳白蛋白，缺乏β-乳球蛋白，具有與母乳相似的蛋白結(jié)構(gòu)，因此引起的過敏反應(yīng)會大大降低[13]。目前多項研究證明，駝乳中含有豐富的ACE抑制肽，有研究者發(fā)現(xiàn)駝乳的全酪蛋白和β-酪蛋白經(jīng)消化水解后，抗氧化活性和ACE抑制活性得到明顯提高[14]。也有研究者對駝乳在不同蛋白酶水解下的產(chǎn)物ACE抑制活性進行比較，并分離出具有降血壓功能的肽段[15-16]。同時，對比不同菌株發(fā)酵后駝乳和牛乳的活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵后的駝乳具有較高的抗氧化活性和ACE抑制活性，對人結(jié)直腸腺癌細胞（Caco-2）、人乳腺癌細胞（MCF-7）和人宮頸癌細胞（HELA）有較強的增殖抑制作用[17]。發(fā)酵后的駝乳對自發(fā)性高血壓大鼠的降血壓效果更好，其ACE抑制活性也更強[18]。同時有研究者通過質(zhì)譜檢測在水解后駝乳樣品中發(fā)現(xiàn)多種具有ACE抑制活性的肽段[19]。目前國內(nèi)研究大多針對牛乳或羊乳，對駝乳的ACE抑制肽活性研究報道較少。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，駝乳的確能夠?qū)Ω哐獕捍笫笃鸬浇档脱獕旱淖饔茫勅檫M入體內(nèi)需要經(jīng)過胃腸道的消化，因此本研究在體外模擬駝乳酪蛋白在體內(nèi)的消化過程，檢測水解液對ACE的抑制活性，對駝乳酪蛋白降血壓能力進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳采自新疆烏魯木齊市紅雁池哈薩克村牧民家準噶爾雙峰駝。

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）標準品、ACE、Tris、甲醛、卡托普利 美國Sigma公司；馬尿酸（hippuric acid，HA）標準品 日本東京化成工業(yè)株式會社；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）上海藍季科技發(fā)展有限公司；乙腈 美國Fisher公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、硼砂、硼酸（均為分析純） 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10ATvp高效液相色譜儀（配備UV檢測器（SPD-10Avp）和脫氣裝置（DGU-12A）） 日本島津公司；Shimpack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm） 日本島津公司；PHS-2F精密pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；3K30低溫離心機 德國Sigma公司；SHB-BA15華牌循環(huán)水真空泵 河南鞏義市英峪予華儀器廠；B3200S超聲波清洗儀 美國Branson公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超濾離心管（50、10、3 kDa） 美國Millipore公司；ALPHA 1-2 LD真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；基質(zhì)輔助激光解析電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）蛋白質(zhì)組分析儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 駝乳酪蛋白的制備

駝乳用4 層無菌紗布過濾除去雜質(zhì)，3 500 r/min離心15 min，除去上層脂肪，反復(fù)多次離心，直至上層無脂肪為止，收集脫脂乳，備用。用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6，8 000 r/min離心10 min，沉淀部分（酪蛋白）用溫蒸餾水反復(fù)沖洗3 次，冷凍干燥，備用。

1.3.2 駝乳酪蛋白的單酶水解和復(fù)合酶水解

單酶水解：采用2 種蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）分別水解駝乳酪蛋白。酪蛋白溶解于0.05 mol/L NaOH，底物質(zhì)量濃度為5 g/100 mL，攪拌溶解，40 ℃預(yù)水浴，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl分別調(diào)節(jié)至pH 2（胃蛋白酶）和pH 8（胰蛋白酶）；加入2%蛋白酶，反應(yīng)過程中持續(xù)滴加NaOH或HCl維持反應(yīng)體系pH值，分別水解0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h，取樣，測定蛋白質(zhì)水解度。反應(yīng)結(jié)束后，水解液經(jīng)90 ℃水浴15 min滅酶，迅速冷卻到40 ℃，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.6，冷卻，4 000 r/min低溫離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，冷凍干燥后冷藏，待分析。實驗重復(fù)3 次。

復(fù)合酶水解：在底物質(zhì)量濃度5 g/100 mL、酶底比（E/S）0.4、水解溫度37 ℃、pH 2.0的條件下進行胃蛋白酶單酶水解，水解2 h后，90 ℃水浴15 min滅酶，冷卻至37 ℃后，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值至8，加入胰蛋白酶水解，分別在反應(yīng)后0.5、1、2、3、4 h取酶解產(chǎn)物，90 ℃水浴15 min滅酶，迅速冷卻到40 ℃，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.6，冷卻，4 000 r/min低溫離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，冷凍干燥后冷藏，待分析。實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度測定

蛋白質(zhì)水解度按式（1）計算。

式中：h為水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)/（mmol/g）；htot為每克蛋白所含的肽鍵毫摩爾數(shù)（8.3 mmol/g）。

式（1）中，h按式（2）計算。

式中：ρ為底物蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；c為水解液中氨基氮濃度/（mmol/mL）；c0為未水解底物溶液中氨基氮濃度/（mmol/mL）。

氨基氮濃度測定：采用甲醛滴定法，取樣品溶液10 mL置于小燒杯中，加入30 mL超純水，在攪拌狀態(tài)下以精密酸度計測定pH值；用0.05 mol/L NaOH標準溶液預(yù)滴定至pH 8.2，再加入10 mL中性甲醛，1 min后用0.05 mol/L NaOH標準溶液滴定至pH 9.2，并記錄消耗的NaOH標準溶液體積。

溶液中氨基氮濃度按式（3）計算。

式中：0.05為NaOH標準溶液濃度/（mol/L）；V0為空白組消耗NaOH標準溶液體積/mL；V1為樣品溶液消耗NaOH標準溶液體積/mL；V2為樣品溶液體積/mL。

1.3.4 ACE抑制率測定

1.3.4.1 樣本制備

采用HHL方法檢測ACE體外抑制率。

硼酸鹽緩沖液配制：用超純水配制含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L、pH 8.3硼酸鹽緩沖液。

HHL溶液配制：將HHL溶于硼酸鹽緩沖液，溶液濃度為5 mmol/L，分裝成1 mL，－20 ℃保藏。

ACE溶液配制：將0.25 U ACE用含有0.3 mol/L NaCl的50 mmol/L、pH 7.5 Tris-HCl溶液溶解，溶液濃度為100 mU/mL，分裝成250 μL，－20 ℃保藏。

對照組加入100 μL HHL溶液和25 μL硼酸鹽緩沖液，樣品組加入100 μL HHL溶液和25 μL酶解液，37 ℃水浴10 min，樣品組和對照組各加入10 μL ACE溶液，37 ℃水浴30 min，4 500 r/min離心5 min，各加入100 μL 1 mol/L HCl，終止反應(yīng)后的樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾，待檢測。

1.3.4.2 反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法檢測

檢測條件：Shim-pack VP-ODS色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：體積分數(shù)0.05% TFA-水溶液，流動相B：體積分數(shù)0.05% TFA-乙腈；檢測波長228 nm；流速0.5 mL/min；梯度洗脫程序：0～10 min、流動相B體積分數(shù)5%～60%，10～12 min、流動相B體積分數(shù)60%，12～13 min、流動相B體積分數(shù)60%～5%，13～17 min、流動相B體積分數(shù)5%；進樣量20 μL；溫度25 ℃；外標法定量。

酶解產(chǎn)物樣品用超純水溶解至0.4 mg/mL，ACE抑制率按式（4）計算。

式中：S對照為空白對照組HA的峰面積/（mAU·S）；S樣品為添加酶解液組HA的峰面積/（mAU·S）。

取HA標品，用硼酸鹽緩沖液配制1 mg/mL母液，再用緩沖液稀釋成0.01、0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mg/mL，色譜方法檢測ACE抑制率，每個標準溶液平行測定3 次，取平均值，繪制標準曲線。

1.3.5 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物的超濾分離

駝乳酪蛋白的酶解產(chǎn)物用超濾離心管進行50、10、3 kDa超濾分離，測定截留液的ACE抑制活性。

1.3.6 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物與卡普里托抑制特性的比較

對比0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mmol/L底物（HHL）濃度下，0.4 mg/mL酪蛋白胰蛋白酶水解產(chǎn)物和0.02 μmol/L卡普里托對ACE的抑制活性，以Lineweaver-Burk作圖法確定抑制劑對酶促反應(yīng)的抑制類型，然后根據(jù)抑制類型應(yīng)用作圖法，根據(jù)米-曼式方程，求出抑制常數(shù)（Ki）。

1.3.7 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物截留液的質(zhì)譜檢測

將3～10 kDa的截留液樣品用于MALDI-TOF/TOF分析，在NCBI上查詢相關(guān)蛋白信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel和Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行線性關(guān)系和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳酪蛋白水解產(chǎn)物中所含HA在RP-HPLC中的響應(yīng)

以HA標品質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫軸，峰面積（y）為縱軸繪制標準曲線，得到線性方程為y=6×106x＋123 872（R2=0.998 4），表明HA在0.01～1.00 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為94.45%，相對標準偏差為3.2%，該方法的穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性的相對標準偏差分別為1.51%、1.38%和1.03%，干擾較少、分析時間短、穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性良好，此方法用于檢測ACE抑制活性穩(wěn)定可靠。

圖1 HA溶液和駝乳酪蛋白水解產(chǎn)物的RP-HPLC響應(yīng)色譜圖Fig. 1 RP-HPLC chromatograms of HA and camel casein hydrolysates

HA溶液和駝乳酪蛋白水解產(chǎn)物中HA的RP-HPLC響應(yīng)色譜圖如圖1所示。

2.2 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率

圖2 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物水解度和ACE抑制率隨時間的變化Fig. 2 Changes in hydrolysis degree and ACE inhibition activity of camel milk casein with hydrolysis time

由圖2A、2B可知，由于蛋白酶水解位點的特異性，對酪蛋白的水解能力有所不同，同一時間，2 種蛋白酶水解酪蛋白的水解度不同。胃蛋白酶的水解能力最弱，其可斷裂苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸等疏水性氨基酸殘基的氨基端肽鍵，水解度小于5%，未水解底物較多，水解2 h，ACE抑制率為74.67%左右。胰蛋白酶專一性較強，只斷裂賴氨酸殘基或精氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵，在水解4 h后，駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物水解度達到15%以上，ACE抑制率在2 h達到72.33%。2 種酶水解2 h時的ACE抑制率差異明顯，水解12 h內(nèi)的水解度差異明顯，底物蛋白經(jīng)蛋白酶水解一定時問后，反應(yīng)體系中存在未水解大分子蛋白和部分水解的蛋白。

由圖2C、2D可知，駝乳酪蛋白在雙酶聯(lián)合酶解條件下，與單酶水解相比，組合酶解后酶解產(chǎn)物的水解度迅速上升，均高于單酶水解的水解度。水解度的增加表明酶解產(chǎn)物中氨基酸含量增加，即底物蛋白在雙酶水解作用下產(chǎn)生了更多短肽，酪蛋白在單酶水解作用一定時間后，底物中敏感肽鍵含量降低，由于酶作用的位點特異性使反應(yīng)速率變慢，水解度變化趨向平緩，具有活性的多肽保持平衡，具有ACE抑制活性的多肽含量達到一定值不再增加，或是增加緩慢。而雙酶水解酪蛋白時，由于酶作用位點不同，溶液中的大分子多肽段在酶作用下發(fā)生變化，溶解肽段含量增加，水解度升高，但ACE抑制率并不隨著水解度的增加而增加，當(dāng)進行雙酶水解時，加入胰蛋白酶可能作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降。

2.3 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物半抑制質(zhì)量濃度（half inhibitory concentration，IC50）及超濾組分ACE抑制活性

以酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的對數(shù)值作為橫坐標，ACE抑制率作為縱坐標，在質(zhì)量濃度0.01～0.80 mg/mL范圍內(nèi)得出線性關(guān)系：y=0.330 7x＋0.996 8（R2=0.996 8），通過計算求出酪蛋白酶解產(chǎn)物的IC50為0.198 9 mg/mL。

圖3 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物不同超濾液組分的ACE抑制率Fig. 3 ACE inhibitory activity of different fractions of ultrafiltration

由圖3可知，酪蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)過50、10、3 kDa截留后，表現(xiàn)出不同的ACE抑制率，3 kDa截留液的ACE抑制活性最強。

2.4 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物對ACE的抑制特性

表1 不同HHL濃度下水解產(chǎn)物中多肽及卡托普利的ACE抑制率Table 1 ACE inhibitory activity of casein peptides and captopril at different concentrations of HHL

由表1可知，卡托普利對ACE的抑制率隨底物濃度的降低而增加，這是競爭性抑制的典型表現(xiàn)，底物的增加與抑制劑競爭與酶結(jié)合，減輕了抑制劑對酶的抑制作用。不同底物濃度條件下，水解產(chǎn)物中多肽的ACE抑制率無明顯差異，由此可見，增加底物濃度不能消除多肽對ACE的抑制，符合非競爭性抑制劑的特點。

為研究水解產(chǎn)物對ACE抑制作用的特性，以Lineweaver-Burk作圖法確定抑制劑對酶促反應(yīng)的抑制類型，然后根據(jù)抑制類型應(yīng)用作圖法求得抑制常數(shù)（Ki）。

以Dixon作圖法求取多肽對ACE的Ki，以抑制劑質(zhì)量濃度為橫坐標，以1/v為縱坐標，采用2 個底物濃度，繪制線性曲線，計算水解產(chǎn)物的Ki，如圖4A所示，直線交點的橫坐標為Ki，為0.25 mg/mL。

測定在不同底物濃度條件下，加入不同濃度的多肽、卡托普利與未加入抑制劑時的ACE抑制活性。由圖4B、4C可知，代表不同底物水解物的幾條直線與橫軸相交，直線斜率和縱軸截距隨水解產(chǎn)物濃度的增大而增大，可推斷酶解產(chǎn)物對ACE的抑制為非競爭性抑制。卡托普利是典型的ACE競爭性抑制劑，在抑制劑存在時，直線斜率增大，與無抑制劑的曲線相交于縱軸。

2.5 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物3～10 kDa截留液中的肽段

3～10 kDa截留液通過質(zhì)譜檢測得到的主要蛋白質(zhì)和肽段如表2～3所示。

表3 駝乳酪蛋白酶解產(chǎn)物3～10 kDa截留液中酪蛋白肽段序列Table 3 Sequences of casein peptides in 3- 10 kDa retenate

由表2～3可知，3～10 kDa組分中含有多種乳清蛋白肽段，這可能是在酪蛋白的制備過程中，乳清蛋白共沉淀下來，分離不佳。其中乳鐵蛋白含量較高，存在66 個小分子肽段，乳鐵蛋白不僅是中性粒細胞的組成成分，同時有增強免疫力和抗氧化等生物功能。同時也發(fā)現(xiàn)了存在和氧化應(yīng)激相關(guān)的101 個肽段，大部分來自谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和超氧化物歧化酶，這為駝乳具有抗氧化功能的效果提供了理論基礎(chǔ)。同時還發(fā)現(xiàn)其具有多種瘦素以及和糖原合成相關(guān)的糖原合酶1型蛋白和降低血糖的胰島素肽段共295 個，這也與駝乳能夠降低脂肪堆積和起到降糖效果相對應(yīng)。在來源于血紅蛋白亞基β和酪蛋白前體肽段中，發(fā)現(xiàn)2 條多肽結(jié)構(gòu)與已知具有ACE抑制活性多肽（LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR）相似，這也為水解液的ACE抑制活性提供了理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

駝乳原本的ACE抑制活性較低，但經(jīng)過蛋白酶水解后，酪蛋白的ACE抑制活性增加，最終確定胰蛋白酶水解后的酪蛋白水解產(chǎn)物IC50為0.198 9 mg/mL。食物蛋白源的ACE抑制肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)獲得，由于酶作用位點特異性，酶解產(chǎn)物的肽鏈長度及肽段結(jié)構(gòu)與蛋白酶的選擇相關(guān)。水解液中含有ACE抑制肽和無ACE抑制活性的多肽、游離氨基酸等多種物質(zhì)，這些組分在酶的作用下發(fā)生變化，過程復(fù)雜，存在多種轉(zhuǎn)化方式，溶液中小分子肽段含量增加，但ACE抑制活性無明顯變化，有研究者認為與酶解液中生成了IC50較低的ACE抑制肽有關(guān)。Cheung等[20]研究認為，ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C端氨基酸，C端氨基酸為芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）和Pro時其抑制活性最強，說明酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性不僅與多肽鏈的長度有關(guān)，也與多肽氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究中雙酶水解酪蛋白，由于酶作用位點不同，溶液中的大分子多肽段在酶作用下發(fā)生變化，溶解肽段含量增加，水解度升高，但ACE抑制率并不隨著水解度的增加而增加，當(dāng)進行雙酶水解時，加入胰蛋白酶可能作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降，吳建平等[21]在大豆降壓肽的研制中也觀察到了同樣的現(xiàn)象。經(jīng)過3～10 kDa分子截留的組分表現(xiàn)出較強的ACE抑制活性；也有研究者通過蛋白酶K水解駝乳酪蛋白，并將水解產(chǎn)物進行超濾，同樣發(fā)現(xiàn)3 kDa的截留液具有較高的ACE抑制活性，與本研究結(jié)果一致[22]。本研究還發(fā)現(xiàn)駝乳酪蛋白水解產(chǎn)物對ACE的抑制為非競爭性抑制，反應(yīng)底物HHL濃度的增加不能消除多肽對ACE的抑制，多肽的抑制常數(shù)為0.25 mg/mL。降血壓藥物卡托普利是ACE的競爭性抑制劑，其活性基團SH螯合ACE活性中心的Zn2＋，抑制酶的活性[23]。而目前對食源性蛋白多肽對ACE抑制類型的報道不多。有研究者提出對酶促反應(yīng)的抑制作用，非競爭性抑制劑優(yōu)于競爭性抑制劑[24]，這也說明駝乳具有和藥物聯(lián)合用藥的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)了LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR 2 條可能具有ACE抑制活性的多肽。Haines等[25]在鹿茸的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性的多肽LVVYPW、LVVYPWTQ和VVYPWTQ，這與本研究肽段LLVVYPWTR具有較高的相似度，其可能通過相同的空間結(jié)構(gòu)來抑制ACE活性。Chen Li等[26]用復(fù)合酶水解牛乳后發(fā)現(xiàn)了具有抑制作用的肽段VLPVPQ，Soleymanzadeh等[27]利用乳酸菌PTCC1899發(fā)酵駝乳后發(fā)現(xiàn)了β-酪蛋白抗氧化活性肽MVPYPQR，而這2 個肽段與本研究檢出的屬于β-酪蛋白前體的肽段VLPVPQQMVPYPQR具有極高的相似性，不同的是本研究中的肽段是前2 個肽段之間用谷氨酰胺將二者連接。同時在κ-酪蛋白的肽段中具有和ACE抑制肽的肽段IPP相同結(jié)構(gòu)的肽段，但可能由于酶的不同，其肽段過長，并未徹底將肽段IPP分離開，但這也說明水解液中含有多種具有ACE抑制活性的多肽，它們各自具體的抑制活性還需要后續(xù)進行實驗研究，但這些都解釋了駝乳對于輔助治療高血壓方面能起到良好的作用。

總的來說，雙酶水解相比單酶水解，駝乳酪蛋白水解度增加，但ACE抑制活性未隨著水解度的增加而增加，這可能是第2種蛋白酶（胰蛋白酶）作用于具有活性的肽段，因而引起酶活性的下降。經(jīng)水解后的酪蛋白水解物與卡托普利符合非競爭性抑制劑的特點，多肽的抑制常數(shù)為0.25 mg/mL。且水解后3～10 kDa截留物的ACE抑制活性最好，對其質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)了2 條與已知ACE抑制肽結(jié)構(gòu)相似的肽段LLVVYPWTR和VLPVPQQMVPYPQR。