牛乳、驢乳乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能對(duì)比研究

劉愛成，李墨翰，張正翰，張秀敏，劉一鳴，陳佳麗，熱罕古麗，鄭 艷，岳喜慶,*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866；2.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)教學(xué)部，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

驢乳是一種特種乳，其基本組成與人乳較為相近。驢乳中乳清蛋白相對(duì)含量較高，VC含量豐富，鈣磷含量超過人乳[1]；驢乳脂肪含量較低，脂肪酸組成豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，亞麻酸和亞油酸含量高于牛乳和羊乳[2]；驢乳中活性成分較多，如溶菌酶和乳鐵蛋白等，具有增強(qiáng)免疫力、消除炎癥等作用，適合多類人群食用及多種配方食品的生產(chǎn)，具有較大的開發(fā)潛力[3-5]。牛乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，受眾范圍廣，占據(jù)了乳類消費(fèi)市場(chǎng)的絕大多數(shù)份額[6]。牛乳中乳糖、蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，可以為人體提供能量[7]，牛乳中的α-乳白蛋白能為人體提供重要的必需氨基酸，對(duì)嬰幼兒的成長(zhǎng)發(fā)育極為重要[8]。目前嬰幼兒配方乳粉多用牛乳作為基料，但是由于一部分嬰幼兒對(duì)牛乳蛋白過敏，會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)[9]，所以驢乳受到人們的關(guān)注，并逐漸被用于嬰幼兒配方食品的生產(chǎn)。在國(guó)外，驢乳被用于治療牛乳蛋白過敏癥狀，并且取得了較好的療效，因此驢乳也被稱為“低致敏性”乳[10]。

新生兒的能量補(bǔ)充來自蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)等，蛋白質(zhì)能夠補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)及發(fā)揮功能作用，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育[11]。乳清蛋白易于消化吸收，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適合作為嬰幼兒配方食品基料，如通過添加乳清蛋白調(diào)整蛋白比例，使嬰幼兒配方乳粉的組成更接近母乳[12-13]。α-螺旋和β-折疊是蛋白質(zhì)中常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)[14]，每種結(jié)構(gòu)都具有一定的功能，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，能夠作為識(shí)別基序，介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用[15]。傅里葉變換紅外光譜法、核磁共振技術(shù)、圓二色光譜法等是目前較為常用的測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的技術(shù)[16]。在上述方法中，傅里葉變換紅外光譜法因其適用性強(qiáng)，能在多種環(huán)境下對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行定量分析從而被廣泛使用。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛乳和驢乳組成成分和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究較多，但對(duì)于牛乳和驢乳蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)功能的對(duì)比分析較少。

本研究首先通過傅里葉變換紅外光譜分析驢初乳、驢常乳、牛初乳、牛常乳乳清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過OMNIC 8.2和Peakfit 4.12軟件分析譜圖，隨后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)上述4 種乳樣的乳清蛋白進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步利用基因本體論（gene ontology，GO）功能注釋和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）代謝通路分析其功能及差異。比較上述4 種乳樣中乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的差異，將有助于加深對(duì)不同乳源及不同泌乳期乳清蛋白成分的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)更適合嬰幼兒需求的配方乳粉提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛初乳、牛常乳采自沈陽(yáng)沈北新區(qū)伊利牧場(chǎng)，驢初乳、驢常乳采自大連圣鴻道荙驢業(yè)科技發(fā)展有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)，其中初乳采集時(shí)間均為分娩后0～7 d，常乳均為分娩后30～60 d。上述4 種乳樣各采集30 份，于超低溫冰箱（－80 ℃）貯存待用，在實(shí)驗(yàn)前解凍并將同種乳樣充分混合，以排除個(gè)體差異[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀 蘇州貝銳儀器科技有限公司；5804R多功能臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；UniStar 2真空冷凍干燥機(jī) 北京天利聯(lián)合有限公司；1290 Infinity Ⅱ液相色譜儀、強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜（SCX）柱 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.1.1 樣品前處理

每組稱取30 mL乳樣進(jìn)行離心（4 ℃、10 000 r/min、10 min），除去上層脂質(zhì)；隨后將樣品再次離心（4 ℃、12 000 r/min、60 min），使用低溫丙酮法對(duì)上清液進(jìn)行處理，除去酪蛋白，再將上清液凍干，制成乳清蛋白凍干粉[18]。

1.3.1.2 傅里葉變換紅外光譜圖分析

傅里葉變換紅外光譜檢測(cè)前將凍干樣品通過溴化鉀壓片法制樣，制樣后使用衰減全反射全范圍掃描。通過OMNIC 8.2軟件對(duì)樣品譜圖的酰胺Ⅲ帶（1 220～1 330 cm－1）和酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm－1）進(jìn)行處理，再使用Peakfit 4.12軟件對(duì)所得的曲線進(jìn)行最終的處理分析，確定各子峰對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，根據(jù)峰面積求出相對(duì)含量。

式中：X為二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量/%；A為各二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰面積；ΣA為各二級(jí)結(jié)構(gòu)峰面積總和。

1.3.2 蛋白質(zhì)功能測(cè)定

參考張熙桐等[19]的處理方法，提取乳清蛋白后，使用過濾輔助蛋白質(zhì)組制備法進(jìn)行酶解，隨后采用毛細(xì)管高效液相色譜與電噴霧質(zhì)譜法對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。再利用GO功能注釋及KEGG代謝通路對(duì)乳清蛋白的生物學(xué)功能及參與的代謝通路進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，選用SPSS（version 22.0）統(tǒng)計(jì)分析軟件及Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖2 驢初乳（A）、驢常乳（B）、牛初乳（C）和牛常乳（D）乳清蛋白酰胺Ⅰ帶擬合效果Fig. 2 Amide I band curve-fitting results for whey proteins in donkey colostrum (A), donkey milk (B), bovine colostrum (C) and bovine milk (D)

表1 驢初乳、驢常乳、牛初乳和牛常乳乳清蛋白酰胺Ⅰ帶分析結(jié)果Table 1 Secondary structure contents of whey proteins in donkey colostrum, donkey milk, bovine colostrum and bovine milk determined from amide I band

由圖1可知，4 種乳樣光譜圖的變化規(guī)律大致相似，將4 種乳樣原譜圖通過OMNIC 8.2軟件和Peakfit 4.12軟件進(jìn)行處理（圖2），對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行分析，得出每種乳樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)及對(duì)應(yīng)的相對(duì)含量（表1），為更好區(qū)分某些二級(jí)結(jié)構(gòu)基序及更準(zhǔn)確定量，對(duì)酰胺Ⅲ帶進(jìn)行分析[20]（表2）。分析結(jié)果顯示，驢乳和牛乳乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異。驢乳乳清蛋白中α-螺旋及β-折疊相對(duì)含量均高于同期牛乳，而β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量則低于牛乳。與牛初乳相比，牛常乳乳清蛋白中的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量均降低；與驢初乳相比，驢常乳中β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低而α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量升高。驢乳中β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量較高，研究發(fā)現(xiàn)，乳中含有的纈氨酸和異亮氨酸能促進(jìn)β-折疊結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)，驢乳中所含的脯氨酸也有利于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的形成[21]。而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)過多會(huì)導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低，間接影響人體吸收利用，驢常乳乳清蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量最高，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相對(duì)含量最低，因此最適于人體吸收。

表2 驢初乳、驢常乳、牛初乳和牛常乳乳清蛋白酰胺Ⅲ帶分析結(jié)果Table 2 Secondary structure contents of whey proteins in donkey colostrum, donkey milk, bovine colostrum and bovine milk determined from amide III band

蛋白質(zhì)變性后，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而導(dǎo)致β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加[22]。由于驢乳和牛乳在不同泌乳期的成分存在一定的差異，如驢乳中的蛋白質(zhì)含量在泌乳期有先降低后穩(wěn)定上升的趨勢(shì)[23]，因此也可能導(dǎo)致驢乳乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 乳清蛋白GO功能注釋分析

2.2.1 參與的生物過程分析

圖3 4 種乳乳清蛋白參與的生物過程Fig. 3 Biological processes involving whey proteins in four milks

由圖3可知，4 種乳樣乳清蛋白參與的主要生物過程包括代謝過程、對(duì)刺激的反應(yīng)、定位及免疫系統(tǒng)過程等，其中參與代謝過程的乳清蛋白種類數(shù)最多，其次為參與對(duì)刺激的反應(yīng)過程的乳清蛋白種類數(shù)較多。在上述4 種乳樣的乳清蛋白中，驢常乳中參與生物過程的乳清蛋白種類數(shù)最多，其次是驢初乳，牛常乳與牛初乳差別不大。整體來看，牛乳中參與生物過程的乳清蛋白種類數(shù)均低于驢乳，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，驢乳和牛乳參與生物過程的乳清蛋白種類數(shù)均增加，但牛乳增加幅度不大。因此，相較于牛乳，驢乳在生物功能方面更具優(yōu)勢(shì)。由于嬰幼兒的免疫力較低，相較于牛乳，驢乳能更好地增強(qiáng)免疫力，所以配方乳粉可以使用驢乳為基料進(jìn)行研發(fā)，刺激嬰幼兒腸道菌群生成，增強(qiáng)腸道功能，促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育[24-25]。良好的應(yīng)激反應(yīng)也有利于嬰幼兒適應(yīng)外界環(huán)境，維持機(jī)體穩(wěn)定。驢常乳在各過程中參與的乳清蛋白種類數(shù)均最多，發(fā)揮的作用最明顯，說明驢常乳相較于牛乳及驢初乳在生物功能方面更具優(yōu)勢(shì)。

2.2.2 分子功能分析

圖4 4 種乳乳清蛋白參與的分子功能Fig. 4 Molecular functions involving whey proteins in four milks

由圖4可知，調(diào)節(jié)作用是4 種乳樣的乳清蛋白參與最多的分子功能，其次是酶調(diào)節(jié)活性、脂質(zhì)結(jié)合作用、抗氧化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等。整體而言，4 種乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數(shù)存在一定的差距，除轉(zhuǎn)運(yùn)活性外，牛乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數(shù)均少于驢乳；隨著泌乳期的延長(zhǎng)，除抗氧化活性外，牛乳和驢乳中參與分子功能的乳清蛋白種類數(shù)均增加；驢乳中參與調(diào)節(jié)作用和酶調(diào)節(jié)活性的乳清蛋白種類數(shù)較多，且高于牛乳，目前已有研究表明，驢乳能夠調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞活力及與糖代謝有關(guān)酶的活性，對(duì)治療2型糖尿病具有重要作用[26]。蘇德奇等[27]的研究也證明了驢乳的抗氧化功效，能夠?qū)C(jī)體損傷部位產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。驢常乳除參與轉(zhuǎn)運(yùn)活性的乳清蛋白種類數(shù)低于牛常乳，參與其余分子功能的乳清蛋白種類數(shù)均最多，相較于牛乳和驢初乳，驢常乳在分子功能上發(fā)揮的作用更明顯。

2.2.3 細(xì)胞組成分析

由圖5可知，驢乳與牛乳乳清蛋白主要參與的細(xì)胞組成有胞外區(qū)部分、細(xì)胞器、胞外體、胞囊等，驢乳和牛乳中參與胞外區(qū)的乳清蛋白種類數(shù)最多。在血液微粒組成上牛乳和驢乳參與的乳清蛋白種類數(shù)差距較小。整體而言，驢常乳乳清蛋白參與細(xì)胞組成的乳清蛋白種類數(shù)最多，驢初乳次之，牛初乳最少。隨著泌乳期的延長(zhǎng)，驢乳和牛乳乳清蛋白參與細(xì)胞組成的乳清蛋白種類數(shù)逐漸增多，驢乳增加幅度較大，牛乳增加幅度較小。胞外區(qū)和細(xì)胞器區(qū)是細(xì)胞組成中2 個(gè)主要區(qū)域，很多細(xì)胞激活反應(yīng)及分子結(jié)合均發(fā)生在胞外區(qū)。膜性細(xì)胞器是一種相對(duì)局域化的空間結(jié)構(gòu)，由膜包裹，在機(jī)體內(nèi)有序行使細(xì)胞分裂、增殖、呼吸作用等生物學(xué)功能[28]。牛乳乳清蛋白參與細(xì)胞組成的乳清蛋白種類數(shù)與驢乳乳清蛋白存在明顯差距，由此可見，驢常乳更有助于促進(jìn)嬰幼兒機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞組成，且很大程度上優(yōu)于牛乳。

圖5 4 種乳乳清蛋白參與的細(xì)胞組成Fig. 5 Cellular components involving whey proteins in four milks

2.3 4 種乳乳清蛋白參與的KEGG通路分析

表3 4 種乳乳清蛋白參與KEGG通路種類數(shù)Table 3 Number of KEGG pathways involving whey proteins in four milks

由表3可知，通過KEGG通路分析得出，驢乳乳清蛋白參與的KEGG通路數(shù)量多于牛乳，驢初乳、驢常乳乳清蛋白分別參與17、28 條KEGG代謝通路，而牛初乳、牛常乳則分別參與3、10 條KEGG代謝通路。隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，牛乳和驢乳乳清蛋白參與的KEGG通路數(shù)量均增加，4 種乳存在3 條共同的KEGG通路，且都與代謝、免疫和疾病相關(guān)，關(guān)乎嬰幼兒的成長(zhǎng)發(fā)育。以系統(tǒng)性紅斑狼瘡為例，兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制與多因素有關(guān)，包括遺傳、環(huán)境和免疫系統(tǒng)失調(diào)等，導(dǎo)致機(jī)體組織器官出現(xiàn)炎癥和損傷[29]。牛乳和驢乳中存在的吞噬通路、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，能夠調(diào)節(jié)免疫，起到一定的預(yù)防作用。

吞噬及補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)是驢常乳乳清蛋白主要參與的功能，乳清蛋白能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)人體免疫功能[30]。補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)相互關(guān)聯(lián)，維持體內(nèi)平衡，補(bǔ)體C3為補(bǔ)體成分之一，能夠激活凝血功能[31]。從整體來看，驢常乳乳清蛋白參與的KEGG通路最為豐富，且參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、溶酶體、抗生素生物合成等，對(duì)于人體蛋白質(zhì)的新陳代謝及免疫功能等方面具有重要價(jià)值。綜上可知，驢常乳相較于驢初乳、牛初乳和牛常乳更適合作為嬰幼兒功能性食品原料。

3 結(jié) 論

目前，通過傅里葉變換紅外光譜法對(duì)比乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究較少。本研究通過對(duì)驢常乳、驢初乳、牛常乳和牛初乳乳清蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)比它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能差異性，為進(jìn)一步利用不同泌乳期的牛乳與驢乳改良現(xiàn)有乳粉、開發(fā)更適用于嬰幼兒體質(zhì)的新型配方乳粉提供了一定的數(shù)據(jù)參考。通過傅里葉變換紅外光譜對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可知，驢乳和牛乳乳清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定的差異，驢乳乳清蛋白中常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量高于牛乳，驢初乳與驢常乳乳清蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量相差不大，牛常乳中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量最低。與人乳中常見的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，驢常乳整體與人乳最為接近。通過GO功能注釋和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，驢乳和牛乳在生物學(xué)功能和參與的代謝通路方面也存在一定的差異。驢乳乳清蛋白參與的生物學(xué)功能和代謝通路的數(shù)量均高于牛乳，且驢常乳和牛常乳參與的KEGG通路種類數(shù)均多于初乳。整體而言，隨著泌乳期的延長(zhǎng)，4 種乳中參與生物學(xué)功能和代謝通路的乳清蛋白種類數(shù)均增多，其中驢常乳乳清蛋白發(fā)揮的功能作用最明顯，更有益于嬰幼兒配方乳粉的改良。