lncRNA MALAT1靶向miR-532-3p對腦出血繼發(fā)腦損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞模型凋亡和氧化損傷的影響

權(quán) 瑜,王舉波,程格慶,李 娜,李小冬,屈 佩,王茂德

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710004;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:maodewang@163.com)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種嚴重的腦血管疾病,發(fā)病率逐年增加且呈低齡化趨勢,然而,盡管針對該病的臨床治療方法取得了顯著進展,但45歲以上患者的死亡率仍較高[1]。研究表明,氧化應(yīng)激在ICH繼發(fā)性腦損傷中起著重要作用,可誘導腦微血管內(nèi)皮細胞(CMECs)損傷,進而破壞血腦屏障、引起腦水腫和細胞凋亡[1]。因此,有效減輕CMECs氧化損傷對防治ICH繼發(fā)性腦損傷意義重大。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,可通過調(diào)節(jié)基因表達參與調(diào)控CMECs功能,在腦血管疾病進展中發(fā)揮功能[2,3]。lncRNA肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)最初被認為與肺癌如小細胞肺癌的惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)[4],隨后在結(jié)腸癌[5]等其他腫瘤中均被證實具有致癌作用。近年研究[6]指出,糖尿病性腎病小鼠腎皮質(zhì)中MALAT1表達增加,干擾其表達可逆轉(zhuǎn)高糖誘導的足細胞損傷;另外,在冠心病的研究中發(fā)現(xiàn),敲低MALAT1可增強心肌細胞活力、促進細胞周期進程,并抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡[7]。然而,MALAT1在ICH時CMECs中的表達情況及其是否參與CMECs損傷,尚無研究。

由生物信息分析[8]發(fā)現(xiàn),miR-532-3p是MALAT的下游潛在靶點,可抑制腦缺血/再灌注所致氧化應(yīng)激損傷,但MALAT1是否可通過靶向miR-532-3p進而參與ICH時CMECs的氧化損傷尚不清楚,因此,本研究擬采用過氧化氫(H2O2)誘導大鼠CMECs(RCMECs)模擬ICH繼發(fā)性腦損傷的CMECs狀態(tài),進而研究MALAT1和miR-532-3p表達對ICH繼發(fā)性RCMECs凋亡和氧化損傷的影響,并探討MALAT1和miR-532-3p在其中的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞RCMECs及其專用完全培養(yǎng)基購于武漢普諾賽生命科技公司;H2O2購于蘇州晶瑞化學有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq、miRNA第一鏈合成試劑盒、miRNA qPCR試劑盒購于大連Takara公司;MALAT1小干擾RNA(si-MALAT1)及其對照(si-NC)、miR-532-3p模擬物(miR-532-3p mimics)及其對照(miR-mimics-NC)、miR-532-3p抑制物(miR-532-3p inhibitor)及其對照(miR-inhibitor-NC)、異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海生工公司;大鼠丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒購于北京索萊寶公司;兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體、兔抗鼠β-肌動蛋白(β-actin)抗體、兔抗鼠Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)抗體、羊抗兔IgG二抗購于上海碧云天公司;含有miR-532-3p結(jié)合位點的MALAT1野生型(WT)序列或其突變(MUT)體的熒光素酶報告載體WT-MALAT1、MUT-MALAT1由北京華大基因公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建

RCMECs采用普諾賽公司RCMECs專用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。按照1 ∶3比例傳代,取第3代對數(shù)期細胞進行實驗。參考文獻[9,10],用0.125 mmol/L的過氧化氫處理RCMECs 30 min以建立ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型。

1.3 雙重熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

使用Starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測MALAT的下游潛在靶點。利用Lipofectamine 2000將WT-MALAT1或MUT-MALAT1分別與miR-mimics-NC、miR-532-3p mimics共轉(zhuǎn)染細胞,并分別定義為miR-mimics-NC組、miR-532-3p mimics組。培養(yǎng)48 h收集并裂解細胞,按照雙重熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)操作說明進行相對熒光素酶活性測定,以驗證MALAT與miR-532-3p的靶向結(jié)合關(guān)系。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 驗證MALAT1與miR-532-3p的靶向調(diào)控關(guān)系 RCMECs以2×105個細胞/孔的濃度接種于6孔板,細胞融合率為60%時,將細胞分為si-NC組和si-MALAT1組,分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染si-NC和si-MALAT1,轉(zhuǎn)染后48 h進行實時定量PCR(RT-qPCR)檢測MALAT1及miR-532-3p的表達情況,以驗證二者的靶向調(diào)控關(guān)系。

1.4.2 驗證RCMECs氧化損傷模型中MALAT1和miR-532-3p的表達情況 同上進行細胞培養(yǎng)后,將細胞分為control組和H2O2組,control組為繼續(xù)培養(yǎng)48 h的正常RCMECs,H2O2組為正常RCMECs經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后按照1.2.1的方法所建立的氧化損傷模型,control組和H2O2組均采用RT-qPCR檢測RCMECs氧化損傷時MALAT1和miR-532-3p的表達情況。

1.4.3 驗證沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響 以control組及H2O2組作為對照,H2O2-si-NC組和H2O2-si-MALAT1組分別使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染si-NC和si-MALAT1,轉(zhuǎn)染48 h后按照1.2.1的方法建立氧化損傷模型,隨后行RT-qPCR檢測MALAT1表達,并檢測細胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相關(guān)蛋白表達情況,以驗證MALAT1對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型的作用。

1.4.4 驗證過表達miR-532-3p對RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響 以control組及H2O2組作為對照,H2O2-miR-mimics-NC組和H2O2-miR-532-3p mimics組分別轉(zhuǎn)染miR-mimics-NC和miR-532-3p mimics,轉(zhuǎn)染48 h后建立氧化損傷模型,隨后行RT-qPCR檢測miR-532-3p表達,并檢測細胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相關(guān)蛋白表達情況,以驗證miR-532-3p對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型的作用。

1.4.5 驗證抑制miR-532-3p對MALAT1沉默的RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響 以control組及H2O2組作為對照,H2O2-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC組和H2O2-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor組分別共轉(zhuǎn)染si-MALAT1與miR-inhibitor-NC、si-MALAT1與miR-532-3p inhibitor,轉(zhuǎn)染48 h后建立氧化損傷模型,隨后行RT-qPCR檢測miR-532-3p表達,并檢測細胞凋亡、MDA含量、SOD和CAT活性以及凋亡相關(guān)蛋白表達情況,通過Rescue實驗驗證MALAT1/miR-532-3p對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型的作用及調(diào)控機制。

1.5 方法

1.5.1 RT-qPCR檢測MALAT1和miR-532-3p表達 Trizol法提取細胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq說明書進行RT-qPCR;β-actin作為內(nèi)參檢測MALAT1表達。為檢測miR-532-3p表達,使用miRNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,再用miRNA qPCR試劑盒進行RT-qPCR;U6作為內(nèi)參檢測miR-532-3p表達。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。獲取分析Ct值,并采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。MALAT1上游:5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′,下游:5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAA GGCA-3′;β-actin上游:5′-ACTGCCGCATCCTCTTCCT-3′,下游:5′-TCAACG TCACACTTCATGATGGA-3′;miR-532-3p上游:5′-CGTTTCCAACTGTATG-3′,下游:5′-CAACGGCGGATGGCC-3′;U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.5.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化細胞樣本,預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌2次,隨后重懸細胞于500 μl的Annexin Ⅴ-結(jié)合緩沖液中。依次加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC、5 μl的PI,暗室染色15 min后,采用流式細胞術(shù)分析細胞凋亡。

1.5.3 MDA含量、SOD和CAT活性檢測 收集細胞樣本至離心管中,3 000 r/min離心10 min棄去上清。隨后每4×106個細胞加入1 ml提取液,超聲破碎細胞,4 ℃離心機10 000 r/min離心10 min后收集上清至冰上。按照各試劑盒步驟,分別采用黃嘌呤氧化酶法、化學發(fā)光法、放射免疫法測定MDA含量、SOD活性和CAT活性。

1.5.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測Bcl-2和Bax表達量 RIPA緩沖液裂解細胞獲得總蛋白樣品,測定濃度、純度合格后-20 ℃保存?zhèn)溆?。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白,濕法轉(zhuǎn)膜儀進行硝酸纖維素轉(zhuǎn)膜。將膜置于5%脫脂牛奶中室溫下孵育1 h封閉,隨后置于兔抗Bcl-2、Bax、β-actin抗體溶液(稀釋比例為1 ∶500)中室溫下孵育2 h,再用對應(yīng)羊抗兔二抗(稀釋比例為1 ∶1 500)室溫下孵育1 h。暗室內(nèi)進行化學發(fā)光顯色,凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶灰度值,目的蛋白和β-actin蛋白灰度值比值表示其相對表達量。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 MALAT1靶向調(diào)控miR-532-3p

使用Starbase網(wǎng)站預(yù)測顯示,miR-532-3p與MALAT1之間存在潛在靶點(見圖1)。miR-mimics-NC或miR-532-3p mimics分別與WT-MALAT1共轉(zhuǎn)染后,與miR-mimics-NC組比,miR-532-3p mimics組的細胞相對熒光素酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-mimics-NC或miR-532-3p mimics分別與MUT-MALAT1共轉(zhuǎn)染后,miR-mimics-NC組與miR-532-3p mimics組間細胞相對熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

圖1 Starbase網(wǎng)站預(yù)測MALAT1與miR-532-3p的互補關(guān)系Figure 1 Starbase predicts the complementary relationship between MALAT1 and miR-532-3p

表1 MALAT1和miR-532-3p間的熒光素酶報告實驗結(jié)果

由RT-qPCR可見,si-MALAT1組沉默MALAT1表達后,RCMECs中MALAT1相對表達量顯著低于si-NC組,而miR-532-3p相對表達量顯著高于si-NC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 MALAT1靶向負調(diào)控

2.2 ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型中MALAT1和miR-532-3p表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,與control組比較,H2O2組RCMECs中MALAT1相對表達量顯著升高,而miR-532-3p相對表達量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 RCMECs氧化損傷模型中MALAT1和miR-532-3p表達情況比較

2.3 沉默MALAT1對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型凋亡的影響

與control組比較,H2O2組RCMECs中MALAT1相對表達量顯著升高,凋亡率、Bax蛋白相對表達量顯著升高,Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與H2O2-si-NC組比較,H2O2-si-MALAT1組RCMECs中MALAT1相對表達量顯著降低,凋亡率、Bax蛋白相對表達量顯著降低,Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表4、圖2)。

表4 沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型凋亡的影響

圖2 沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Figure 2 Effect of silencing MALAT1 on apoptosis and expression of apoptosis-related proteins in oxidative damage model of RCMECs

2.4 沉默MALAT1對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型氧化損傷的影響

與control組比較,H2O2組RCMECs中MDA含量顯著增加,SOD和CAT活性顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與H2O2-si-NC組比較,H2O2-si-MALAT1組RCMECs中MDA含量顯著降低,SOD和CAT活性顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表5)。

表5 沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型氧化損傷的影響

2.5 過表達miR-532-3p對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響

與control組比較,H2O2組RCMECs中miR-532-3p相對表達量顯著降低,凋亡率、Bax蛋白相對表達量、MDA含量顯著升高,Bcl-2蛋白相對表達量、SOD和CAT活性顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與H2O2-miR-mimics-NC組比較,H2O2-miR-532-3p mimics組RCMECs中miR-532-3p相對表達量顯著升高,凋亡率、Bax蛋白相對表達量、MDA含量顯著降低,Bcl-2蛋白相對表達量、SOD和CAT活性顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表6、圖3)。

表6 過表達miR-532-3p對RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響

圖3 過表達miR-532-3p對RCMECs氧化損傷模型凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Figure 3 Effects of miR-532-3p overexpression on apoptosis and expression of apoptosis-related proteins in oxidative damage model of RCMECs

2.6 抑制miR-532-3p能逆轉(zhuǎn)沉默MALAT1對ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響

與H2O2-si-MALAT1+miR-inhibitor-NC組比較,H2O2-si-MALAT1+miR-532-3p inhibitor組RCMECs中miR-532-3p相對表達量顯著降低,凋亡率、Bax蛋白相對表達量、MDA含量顯著升高,Bcl-2蛋白相對表達量、SOD和CAT活性顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表7、圖4)。

表7 抑制miR-532-3p能逆轉(zhuǎn)沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型凋亡和氧化損傷的影響

圖4 抑制miR-532-3p能逆轉(zhuǎn)沉默MALAT1對RCMECs氧化損傷模型凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Figure 4 Inhibition of miR-532-3p reverses the effect of silencing MALAT1 on apoptosis and expression of apoptosis related proteins of oxidative damage model of RCMECs

3 討論

MALAT1參與細胞增殖、凋亡、分化等關(guān)鍵生物學過程,在多種器官、細胞損傷過程中均發(fā)現(xiàn)其表達異常。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪和復氧誘導的心肌細胞中MALAT1表達增加,干擾MALAT1表達可抑制細胞自噬、降低乳酸脫氫酶釋放,進而保護心肌細胞免受糖氧剝奪復氧損傷。Li等[12]報道睪丸缺血再灌注損傷發(fā)生時,MALAT1表達水平與細胞凋亡呈正相關(guān),與細胞增殖呈負相關(guān)。此外,Yang等[13]證實MALAT1可通過激活p38MAPK通路促進大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細胞PC12凋亡和氧化應(yīng)激從而加重缺氧對PC12細胞的損傷。在神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中,MALAT1的研究相對較少,有研究發(fā)現(xiàn)MALAT1可導致人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)表達增加,而后者是急性腦梗死病理生理基礎(chǔ)動脈粥樣硬化的重要參與因子[14];MALAT1還可通過競爭性結(jié)合miR-145促進腦缺血再灌注損傷[15],然而,MALAT1是否參與ICH繼發(fā)腦損傷,是否在ICH繼發(fā)腦損傷的RCMEC凋亡和氧化損傷中發(fā)揮作用并不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn),采用H2O2誘導構(gòu)建ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型后,MALAT1表達顯著增加,功能缺失實驗顯示沉默MALAT1顯著減弱細胞凋亡。Bcl-2和Bax是細胞重要調(diào)控蛋白,抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加和促凋亡蛋白Bax表達減少可降低線粒體膜的通透性,抑制細胞色素C等凋亡激活因子的釋放進而抑制細胞凋亡[16]。沉默MALAT1后RCMECs氧化損傷模型中Bax蛋白表達顯著降低,Bcl-2蛋白表達升高,與功能缺失實驗結(jié)果吻合。另外,ICH發(fā)生后,大量氧自由基被釋放,可導致膜脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷[1],而SOD和CAT作為機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分,在氧化應(yīng)激時對組織和細胞具有保護作用。本研究中沉默MALAT1可顯著提高RCMECs氧化損傷模型中SOD和CAT活性,并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量。以上研究均表明,沉默MALAT1可抑制H2O2誘導的RCMECs氧化損傷模型中細胞凋亡和氧化損傷。

大量研究證實lncRNA可通過與miRNA結(jié)合并抑制miRNA活性進而在人類疾病中發(fā)揮功能[17]。為探討MALAT1的作用機制,本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實MALAT1與miR-532-3p可靶向結(jié)合,且沉默MALAT1可顯著上調(diào)miR-532-3p表達水平。miR-532-3p來源于miR-532的3′端臂,目前關(guān)于其的研究主要圍繞腫瘤疾病,在心腦血管疾病方面,同樣源于miR-532的miR-532-5p則研究較多。有研究顯示,miR-532-5p可通過靶向心臟內(nèi)與能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)的丙酮酸脫氫酶復合物,減輕缺氧引起的心肌細胞凋亡[18];可降低缺氧復氧誘導的心肌氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制細胞凋亡,減輕心肌細胞損傷[19,20];可通過PTEN/PI3K/AKT途徑減輕缺氧復氧誘導的H9C2心肌細胞損傷[21],或通過上述途徑減小腦梗死后的梗死灶面積并改善神經(jīng)功能缺損、減少細胞凋亡[22];另外,在小鼠大腦中動脈閉塞模型中miR-532-5p表達降低,過表達miR-532-5p可顯著改善模型小鼠神經(jīng)功能障礙、減少梗死面積,并減輕神經(jīng)元損傷和凋亡[23]。而來自同樣miR-532前體的miR-532-3p,雖在腫瘤相關(guān)疾病中研究較多,被發(fā)現(xiàn)可通過阻斷ETS1/TGM2介導的Wnt/β-catenin進而抑制結(jié)直腸癌進展[24],通過調(diào)控結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白(APC)表達抑制β-catenin信號通路進而抑制胃癌進展[25],通過靶向β-catenin抑制淋巴瘤進展[26],但在心腦血管疾病中的相關(guān)研究較少,僅僅被發(fā)現(xiàn)可通過靶向調(diào)控Caspase募集結(jié)構(gòu)域參與阿霉素心臟毒性所致線粒體分裂和細胞凋亡[27],可通過抑制PAPD5表達參與動脈粥樣硬化的進展[28],可通過靶向NADPH氧化酶2(NOX2)抑制腦缺血/再灌注所致氧化應(yīng)激損傷[8],但無論miR-532-5p或miR-532-3p,是否在ICH中發(fā)揮作用尚不明確。

本研究顯示,H2O2誘導構(gòu)建ICH繼發(fā)腦損傷的RCMECs氧化損傷模型后,RCMECs中miR-532-3p表達顯著降低,過表達miR-532-3p可顯著抑制Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達、減輕RCMECs氧化損傷和凋亡,與沉默MALAT1的作用吻合。通過進一步恢復實驗發(fā)現(xiàn),抑制miR-532-3p還可部分逆轉(zhuǎn)MALAT1沉默對H2O2誘導的RCMECs氧化損傷和凋亡的保護作用,這進一步證實靶向負調(diào)控miR-532-3p是MALAT1參與H2O2誘導的RCMECs凋亡和氧化損傷的重要機制。另外,其下游信號通路是否與miR-532-5p存在交叉,是否與其在調(diào)控腫瘤進展中的信號通路有關(guān),尚需進一步深入研究。

總之,沉默MALAT1通過靶向上調(diào)miR-532-3p可抑制H2O2誘導的RCMECs凋亡和氧化損傷。因此,調(diào)控MALAT1/miR-532-3p途徑可能是防治ICH繼發(fā)性腦損傷的可能策略,然而上述途徑的下游信號通路仍需進一步研究。