和田羊和小尾寒羊尾脂的顯微和超微結構比較

翟少華，向微微，胡美荷，孫亞偉，蒙建菊，葉夢珺，候萌，阿麗雅，王金泉*，胡燕

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 新疆維吾爾自治區(qū)科技人才開發(fā)中心，新疆 烏魯木齊 830011)

新疆是我國重要的羊養(yǎng)殖和羊肉生產(chǎn)地區(qū)，其肉羊品種也以脂臀羊居多，阿勒泰大尾羊成年后尾脂可達體重的17%[1]。養(yǎng)殖業(yè)中，胴體中脂肪的沉積水平是影響肉質的關鍵因素，畜禽脂肪過度沉積會影響畜禽的生產(chǎn)效能[2]?，F(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中的過量脂肪是畜禽業(yè)面臨的主要問題之一[3-4]。羊尾脂是指綿羊尾內部的大體積脂肪，可食用，目前多用于日化產(chǎn)品的開發(fā)。此外，羊尾脂具有藥用價值，廣泛應用于新疆少數(shù)民族醫(yī)藥[5]。但過多的脂肪沉積不利于生產(chǎn)者和消費者，因為浪費了膳食能量，同時也產(chǎn)生了經(jīng)濟價值較低的產(chǎn)品，降低產(chǎn)量，因此，減少脂肪產(chǎn)生，以及減少脂肪在身體和尾部的沉積，是綿羊產(chǎn)業(yè)的主要目標[6]。

和田羊和小尾寒羊都是新疆地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的肉羊品種，相比于阿勒泰大尾羊，和田羊和小尾寒羊的尾脂沉積較少。有報道稱，油紅O染色下，小尾寒羊尾脂脂肪細胞多呈形態(tài)均勻的卵圓形[7]，但對于和田羊尾脂的形態(tài)學研究和二者的羊尾脂脂肪細胞的顯微、超微結構鮮有報道。本研究通過光學顯微鏡和透射電鏡技術，主要研究和田羊和小尾寒羊尾部脂肪細胞顯微、超微結構的特點與異同，為進一步探究羊尾部脂肪的形成機制，調控羊尾部脂肪過度沉積奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑

選擇15月齡成年雄性和田羊和小尾寒羊共12只，按品種分為2組，每組6只，去除毛皮的新鮮尾部脂肪，通過2.5%的戊二醛固定液(電鏡保存方法)、速凍方法來保存樣品(冰凍切片保存)。

無水乙醇、二甲苯、丙酮購自于天津市化學試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購自于立杰國際貿(mào)易有限公司；苦味酸、液體石蠟、中性樹膠、油紅O染色液均購自于烏魯木齊市阜瑞克生物科技有限公司；戊二醛、鋨酸購自于金川集團有限公司技術中心；檸檬酸鉛、醋酸鈾購自于湖北楚盛威化工有限公司； Epon 812 包埋劑、OCT冰凍切片包埋劑購自于上海易微信息科技有限公司；環(huán)氧樹脂512、十二烷基琥珀酸(DDSA)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、二乙基苯胺(DEA)、氫氧化鈉、重蒸水、三氯甲烷配制的0.25%福爾蒙瓦爾膜、濃H2SO4均為市售。

1.2 脂肪組織冰凍切片制備

1.2.1 樣本固定

樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4 ℃冰箱預冷5～10 min再用OCT膠浸透包埋組織塊。取下組織并置于錫箔或者玻片上，并將其放置樣品托上，再添一層OCT膠，完全覆蓋，置速凍架(PE)上30 min。

1.2.2 冰凍切片

恒溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置于低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至5～10 μm。切片時，低溫室內溫度以-15～-20 ℃為宜，切好的切片室溫放置30 min后，烘箱干燥20 min，室溫自然冷卻。

1.3 油紅O染色法

1.3.1 油紅O染色液配制

飽和油紅O原液按油紅O∶蒸餾水=3∶2加入蒸餾水，混勻，室溫放置5～10 min ，過濾后使用。

1.3.2 染色步驟

切片用甲醛-鈣固定10 min；蒸餾水充分洗滌；60%異丙醇浸洗；油紅O染液染色10 min(染液可回收再利用)；60%異丙醇分化至間質清晰；蒸餾水洗；Mayer蘇木素復染；蒸餾水洗；甘油明膠封片。

顯微鏡觀察結果：組織細胞中脂滴呈鮮紅色，細胞核呈藍紫色，間質無色。60%異丙醇分化，可在鏡下控制至脂肪組織呈鮮紅色，間質無色。

1.4 脂肪組織透射電子顯微鏡鏡樣品制備

剪取一小塊組織，用雙面刀片將材料切成約1 mm × 1 mm × 3 mm的長塊，逐一放入盛有預冷的新鮮2.5%戊二醛固定液的小管中，放入冰箱4 ℃低溫固定24～48 h 。

取和田羊和小尾寒羊尾部脂肪組織樣 1 mm3，用 2.5%戊二醛固定液固定24 h，然后以0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3 ～ 5 次，15～20 min/次；再用 2%鋨酸固定3 h 。固定后用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗樣品，重復3～5 次，15～20 min/次；將固定的樣品分別在30%、50%、70%、80%、90%、100%系列濃度乙醇由低到高逐級加入到原固定瓶中脫水，各濃度脫水15 min；脫水后分別在無水乙醇∶丙酮(比例為1∶1)、無水乙醇∶丙酮(比例為 1∶4)、純丙酮中置換，各30 min；置換后用 Epon 812 包埋劑∶丙酮(比例為1∶1)、Epon 812 包埋劑∶丙酮(比例為4∶1)、Epon 812 包埋劑滲透，各3 h ；滲透后用 Epon 812 包埋劑進行包埋，聚合條件為37 ℃聚合12 h ，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h ；對聚合好的聚合塊進行修塊、切片，超薄切片厚度為70～100 nm；用醋酸鈾染色液和檸檬酸鉛染色液分別染色20 min，然后再用水沖洗；將染色后的銅網(wǎng)放在鋪有濾紙的平皿中晾干，將染色好的切片置透射電子顯微鏡下，觀察并記錄細胞內細胞器的超微結構。

2 結果與分析

2.1 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪組織顯微結構

光學顯微鏡下觀察，結果如圖1所示。脂肪組織切片染色均勻，脂滴無色，細胞核呈藍紫色緊貼于細胞膜的一側。視野下可見和田羊尾脂的脂肪細胞呈扁橢圓形，排列緊密，間質結構較少，細胞數(shù)量多(圖1A)；小尾寒羊尾脂細胞脂滴較大，細胞輪廓清晰，間質結構多，細胞數(shù)量少(圖1B)。由圖2可見，和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪細胞間的長徑差異不顯著(P>0.05)，和田羊尾脂脂肪細胞短徑和細胞面積極顯著小于小尾寒羊(P<0.01)。

A.和田羊尾脂；B.小尾寒羊尾脂

A. 脂肪細胞長徑長度；B. 脂肪細胞短徑長度；C. 脂肪細胞面積；數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準誤”，**表示差異極顯著(P<0.01)

2.2 和田羊、小尾寒羊尾脂脂肪細胞超微結構的比較

2.2.1 和田羊尾脂脂肪細胞超微結構

在透射電鏡不同放大倍數(shù)下，均不能觀察到一個完整的尾脂脂肪細胞。如圖3所示：透射電鏡下連續(xù)觀察顯示，雙層膜明顯(圖3A、圖3B)，尾脂脂肪細胞內可見一個融合的大脂滴，細胞質和細胞核位于細胞內一側的邊緣，占據(jù)較少空間。細胞周圍的薄層細胞質中含一般的細胞器，如線粒體、內質網(wǎng)等(圖3B～圖3D)，內質網(wǎng)表面光滑，呈螺旋狀緊密排列(圖3E、圖3F)。細胞膜外側發(fā)現(xiàn)有特殊的“絨毛狀”結構，并且周圍分布著較多的黑色點狀顆粒(圖3E、圖3G)，細胞核清晰可見，核膜電子密度較高，邊緣清晰，核質電子密度比胞質高(圖3H)。

圖中阿拉伯數(shù)字1為雙層膜，2為脂滴，3為線粒體，4為絨毛狀結構，5為內質網(wǎng)，6為細胞核，7為核仁，8為細胞間質

2.2.2 小尾寒羊尾脂脂肪細胞超微結構

小尾寒羊尾脂肪細胞內細胞器豐富，在電鏡視野下可以觀察到一個完整的脂肪細胞，如圖4所示。鏡下連續(xù)觀察結果顯示，脂肪細胞細胞膜及細胞間質較寬，在脂肪細胞交界處，清晰可見許多大小、外形不一、散在的脂肪滴(圖4A、圖4B)。細胞中細胞器的特點是：可見內質網(wǎng)密集排列，表面光滑，細胞質內散在分布有大量腫脹呈空泡狀的線粒體，其線粒體在大小、外形及線粒體嵴的排列上也有差異(圖4C至圖4G)。此外，在細胞膜的外側未見明顯“絨毛狀”結構。 脂肪細胞間隙中細胞核體積較大，核仁染色質豐富 (圖4E)。

圖中阿拉伯數(shù)字1為雙層膜，2為脂滴，3為線粒體，4為絨毛狀結構，5為內質網(wǎng)，6為細胞核，7為核仁，8為細胞間質

3 討論

試驗選用的小尾寒羊是經(jīng)雜交選育的優(yōu)良品種，毛質細軟、凈肉率高、肉質好、尾較小、尾脂短[8]，而和田羊是新疆和田地區(qū)特有的地方品種，具有耐干旱、耐粗飼的特點，體格小，產(chǎn)肉性能低、尾短瘦，因此，在已知和田羊與小尾寒羊尾部外觀形態(tài)差異的基礎上，試驗觀察并比較了尾部脂肪細胞組織學和超微結構的異同。結果顯示，和田羊尾脂脂肪細胞呈橢圓形，胞內細胞器豐富，內質網(wǎng)呈螺旋狀分布，線粒體于細胞內邊緣分布，膜外有“絨毛狀”結構和散在的黑色顆粒，這一特殊結構與在阿勒泰大尾羊尾脂脂肪細胞的細胞膜外側發(fā)現(xiàn)的“發(fā)絲狀”結構相似[9]，但其生理功能有待進一步研究。小尾寒羊尾脂脂肪細胞體積大，細胞間質寬，胞內有豐富的未融合的小脂滴，內質網(wǎng)排列整齊并片狀結構清晰，線粒體散在分布在細胞質內。和田羊和小尾寒羊尾脂脂肪細胞形態(tài)結構具有明顯差異。由于試驗動物均來自規(guī)模化養(yǎng)殖場，所以推測這種差異可能與其遺傳特性、脂肪沉積或相關脂代謝基因的存在或表達與否有關。

實驗室前期有研究結果顯示，脂肪與肥胖相關基因(FTO)基因表達水平在阿勒泰大尾羊和小尾寒羊之間存在品種間的差異[1]。綿羊品種之間的比較轉錄組的研究表明，尾脂形成差異也與脂質、脂肪酸代謝相關途徑和細胞連接相關的途徑(如細胞黏附分子)有關[6,10-13]。上述研究結果表明到基因在綿羊尾部脂肪形成和脂質代謝中的重要作用。隨著羊尾部脂肪沉積基因調節(jié)網(wǎng)絡的完善，相關的研究技術有望應用于綿羊優(yōu)良品種的選育、調節(jié)羊體脂質代謝，進而改善綿羊肉質和提高畜牧生產(chǎn)效益。

總之，本次試驗通過對和田羊和小尾寒羊尾脂顯微、超微結構的觀察，對不同品種羊尾脂細胞的超微結構特點有初步的了解，對探究羊尾部脂肪的形成、脂肪代謝機制及種間差異的形成機制具有重要意義。