吐魯番斗雞與新羅曼雞MAOA基因外顯子區(qū)遺傳多態(tài)分析

劉秀霞，廖凱，任艷，廖和榮

(石河子大學(xué)，新疆 石河子 832000)

單胺氧化酶A(MAOA)是去甲腎上腺素(NE)、 5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)的降解酶單胺氧化酶的一個亞型，它參與5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素的代謝，而這些神經(jīng)遞質(zhì)異常與行為異常和許多精神障礙類疾病有關(guān)[1-5]。有研究表明，MAOA基因與攻擊行為有著密切的聯(lián)系[6-8]。攻擊行為是一個復(fù)雜的機(jī)體活動, 不但與多種遺傳因素的協(xié)調(diào)作用有關(guān)，還和環(huán)境因素以及環(huán)境與遺傳之間互作相關(guān)。人們從基因、環(huán)境與行為等方面對MAOA多態(tài)性與早期環(huán)境對個體攻擊行為帶來的影響做了許多研究[9-11]。目前報道的MAOA基因多態(tài)主要有：啟動子區(qū)域的單胺氧化酶A串聯(lián)重復(fù)序列(MAOA-VNTR)[12]，MAOA-LPR低活性等位基因和MAOA-LPR高活性等位基因[13]，第8外顯子MAOA-T941G單核苷酸多態(tài)[14]，第14外顯子MAOA-C1409T多態(tài)性等。研究表明MAOA基因的功能多態(tài)性與個體的沖動，攻擊和反社會行為有關(guān)。最早發(fā)現(xiàn)，人MAOA基因的第8外顯子上936位基因C-T錯義突變，導(dǎo)致了患者的行為異常[6]。隨后又發(fā)現(xiàn),MAOA-VNTR短等位基因更可能是個體發(fā)生暴力攻擊的“危險基因”[9,15-16]。MAOA基因多態(tài)性與攻擊行為的關(guān)系已是當(dāng)前攻擊行為的遺傳基礎(chǔ)研究熱點之一。對人影響攻擊行為相關(guān)基因的研究，已取得部分進(jìn)展,但對于動物的研究還比較少。吐魯番斗雞好斗、骨骼粗壯、身體結(jié)實、戰(zhàn)斗力強(qiáng)是研究攻擊行為的良好素材[17]。因此，本試驗根據(jù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與人攻擊行為相關(guān)的基因MAOA，對吐魯番斗雞攻擊行為相關(guān)的基因的多態(tài)性進(jìn)行研究，旨在找到與雞爭斗行為相關(guān)的基因，從而對動物攻擊行為的遺傳機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用石河子大學(xué)試驗站的新羅曼雞71只，吐魯番斗雞保種場的斗雞103只。雞翅膀靜脈采集血樣2 mL(ACD抗凝劑)，采用酚-氯仿抽提方法提取基因組DNA，-20 ℃保存，備用。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、瓊脂糖、蛋白酶K購自于北京天根生物科技有限公司；PUC19DNA/MspⅠmakers購自上海生物工程公司；Tris飽和酚、丙烯酰胺(Acrylamide)、過硫酸銨(APS)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、蛋白酶K(protein K)、Trise堿購自德國QIAGEN公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank登錄號為NC_006088.5雞單胺氧化酶A基因的DNA序列，利用軟件Primer 5.0針對雞MAOA基因的10個外顯子設(shè)計10對引物，引物序列見表1(引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。

表1 MAOA基因擴(kuò)增的引物序列

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

取PCR產(chǎn)物 10 μL與上樣緩沖液(98%甲酰胺、0.025%二甲苯 氰、2%甘油，0.01 mmol/L EDTA)10 μL混合，在 PCR儀上98 ℃變性10 min，迅速置于冰上冰浴 5 min。用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳12～14 h，根據(jù)電泳圖譜鑒定基因型。分別取不同基因型個體的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化回收后連接到T載體上， 轉(zhuǎn)化B121感受態(tài)細(xì)胞，以藍(lán)斑為對照，挑取陽性重 組菌落，經(jīng)相同的PCR反應(yīng)條件鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.5 統(tǒng)計分析

運用DNASTAR軟件，進(jìn)行基因型頻率和基因頻率檢測、品種內(nèi)的Hardy-weinberg平衡檢測(X2適應(yīng)性檢驗)、有效等位基因、雜合度、多態(tài)信息含量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠檢測,均獲得與目片段大小一致的產(chǎn)物,產(chǎn)物條帶清晰且無雜帶,穩(wěn)定性和特異性好，可直接進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)分析。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)檢測

對MAOA基因的10個外顯子進(jìn)行多態(tài)性檢測,只在引物MAOA1、MAOA2、MAOA5、MAOA7擴(kuò)增的片段檢測到多態(tài)，其中引物MAOA1、MAOA5、MAOA7擴(kuò)增位點NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)在吐魯番斗雞和新羅曼雞上均檢測到多態(tài)，引物MAOA2的擴(kuò)增位點為NC_006088.5 (30260-30535)只在吐魯番斗雞上檢測到多態(tài)。NC_006088.5(25424-25662)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)3種基因型:AA、AB、BB(見圖1)。NC_006088.5 (30260-30535)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)2種基因型:AA、AB(見圖2)。NC_006088.5(34980-35257)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)6種基因型:AA、BC、BB、AB、AC、CC(見圖3)。NC_006088.5(38401-38613)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)3種基因型:AA、BB、AB(見圖4)。

圖1 引物MAOA1的SSCP

圖2 引物MAOA2的SSCP

圖3 引物MAOA5的SSCP

圖4 引物MAOA7的SSCP

2.3 測序分析

測序結(jié)果表明，MAOA1引物擴(kuò)增片段的AB型在該片段第T25541C和 G25614T處有突變，BB型在T25541C處有突變見(見圖5)。

圖5 引物MAOA1擴(kuò)增的片段不同基因型測序結(jié)果

MAOA2引物擴(kuò)增片段的AB型在該片段第T30342C處有突變(見圖6)。

圖6 引物MAOA2擴(kuò)增的片段不同基因型測序結(jié)果

MAOA5擴(kuò)增片段的AA、AB、AC在T35186G處有突變，BB、BC在G35215T處有突變，BB、CC、BC、AC、AB在T35223C處有突變，CC、AC、BC在G35198A、G30489T和G30470T處有突變，CC、BC在G35199A處有突變，BB型在C35133T出現(xiàn)有突變。上述這些突變位點均為同義突變(見圖7)。

圖7 引物MAOA5擴(kuò)增的片段不同基因型測序結(jié)果

2.4 吐魯番斗雞、新羅曼雞兩種雞群各位點的遺傳多態(tài)性檢測結(jié)果

表2 NC_006088.5(25424-25662)、 NC_006088.5 (30260-30535)、 NC_006088.5(38401-38613)在不同雞品種的基因型和基因頻率

表3 NC_006088.5(34980-35257)在不同雞品種的基因型和基因頻率

對吐魯番斗雞和新羅曼雞MAOA1、MAOA2、MAOA5和MAOA7引物擴(kuò)增的基因位點的多態(tài)性參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 MAOA基因擴(kuò)增在兩種雞群體中的遺傳特性

吐魯番斗雞和新羅曼雞群體在MAOA1引物擴(kuò)增的基因位點NC_006088.5(25424-25662)存在兩個等位基因，雜合度分別為0.449、0.456，多態(tài)信息含量分別為0.348、0.352(0.250.5)，群體處于高度多態(tài)。吐魯番斗雞和新羅曼雞群體在MAOA7引物擴(kuò)增的基因位點NC_006088.5(38401-38613)存在2個等位基因，雜合度分別為0.494、0.419，多態(tài)信息含量分別為0.372，0.302(0.25

3 討論

MAOA可調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類遞質(zhì)的水平，對個體的情緒、成癮、沖動、攻擊等起重要作用[18]。茆正洪等[19]的研究認(rèn)為，MAOA基因rs1137070位點多態(tài)性與具有高沖動的反社會人格障礙相關(guān)。針對健康的受試者和有攻擊行為的精神分裂癥患者，通過磁共振 (MRI)研究功能MAOA基因多態(tài)性對腦組織結(jié)構(gòu)和功能的影響發(fā)現(xiàn)，MAOA啟動子區(qū)可變數(shù)目重復(fù)序列多態(tài)性的基因型對男性暴力和攻擊行為的影響更顯著[19-20]。本研究中的NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)位點，在吐魯番斗雞和新羅曼雞上均檢測到多態(tài)，而NC_006088.5 (30260-30535) 位點只在吐魯番斗雞上檢測到多態(tài)，說明NC_006088.5 (30260-30535) 多態(tài)性位點可能與斗雞的攻擊行為相關(guān)，后面將做更進(jìn)一步的研究。

一般用多態(tài)信息含量來衡量基因片段的多態(tài)性。多態(tài)信息含量的高低關(guān)系到該位點的使用效率和可用性，在一個群體中，一個位點多態(tài)信息含量越高說明它的雜合子比例越高，提供的遺傳信息也就越多，根據(jù)多態(tài)信息含量值一般分為高度多態(tài)性(PIC>0.5)、中度多態(tài)性(0.25