酶法米糠制取油脂及蛋白多肽工藝技術(shù)的研究*

于坤弘，陳 星，代雅杰，江連洲，于殿宇，潘明喆**，姚 凱

（1.黑龍江北大荒豐威食品有限公司，哈爾濱 150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；3.湖北天星糧油股份有限公司，湖北 隨州 431500）

在稻米加工的過程中，近60%的營養(yǎng)物質(zhì)殘留在米糠中不被利用[1]。其中，蛋白質(zhì)含量為15%左右，是制備抗氧化、抗肥胖、抗血管增生、抗高血壓等活性肽的良好來源；脂肪含量約為18%～23%，且多不飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸含量較高；無氮浸出物包括淀粉、纖維素和半纖維素等占33%～56%，部分半纖維素構(gòu)成水溶性米糠多糖，糖類物質(zhì)中寡糖鏈易與多肽鏈中的某些氨基酸殘基以糖苷鍵共價(jià)相連形成糖蛋白。此外，米糠還富含維生素E、谷維素、甾醇等生物活性物質(zhì)，因此被美國食品和藥品管理局認(rèn)定為它可以作為食品原料或配料，應(yīng)用于全谷物食品、米糠主食、全谷物早餐等食品行業(yè),米糠營養(yǎng)物質(zhì)的提取和利用也成為一大研究熱點(diǎn)。

但米糠脂肪酶的活性較強(qiáng)，在生產(chǎn)過程中易造成油脂腐敗和蛋白質(zhì)變性。目前國內(nèi)外主要通過化學(xué)法、酶法[2]和物理法等高新技術(shù)鈍化米糠中的脂肪酶，達(dá)到穩(wěn)定米糠的作用，以此提高米糠的利用率。王蕾等[3]在纖維素酶酶解脫脂米糠的基礎(chǔ)上，以堿溶酸沉法為輔助提取米糠蛋白，米糠蛋白的提取率最高為48.97%，純度為74.43%。但化學(xué)法提取蛋白容易發(fā)生化學(xué)殘留，且在反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)易變性。超聲空化效應(yīng)在不破壞米糠細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上直接提取蛋白質(zhì)，有利于獲得純度較高的蛋白質(zhì)，與木瓜蛋白酶結(jié)合米糠蛋白的溶解度可達(dá)74.83%[4]，但由于超聲設(shè)備昂貴，只適用于實(shí)驗(yàn)室研究。

擠壓膨化作為一種物理方法[5-6]，主要是通過擠壓機(jī)螺桿產(chǎn)生的推動(dòng)力，使物料受到混合、攪拌和高剪切力作用，從而發(fā)生膨化。研究表明，擠壓膨化對(duì)米糠中脂肪酶的活性有著明顯的抑制作用，有利于米糠理化性質(zhì)的穩(wěn)定。因此，本研究選用通過擠壓膨化鈍化的新鮮全脂米糠為原料，探究了酶添加量、pH、酶解時(shí)間、酶解溫度、液料比等因素對(duì)鈍化新鮮全脂米糠提油率的影響，并考察了通過添加糖化酶酶解提油后的酶解底物，減少成品中的水溶性糖類物質(zhì)，以提高米糠蛋白多肽產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

鈍化新鮮全脂米糠，湖北天星糧油股份有限公司；對(duì)硝基苯酚基月桂酸酯（p-NPL），山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；Triton X-100，廣州共慶化工有限公司；阿拉伯膠，上海聯(lián)碩生物科技有限公司；纖維素酶：酶活力為700 EGU/g，諾維信公司提供，最適溫度為50～60℃，最適pH為4.5～6.0；堿性蛋白酶200 000 U/g、糖化酶150 000 U/g，南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KTJ16型可調(diào)控的酶膜反應(yīng)器Φ 1.6×2.0 m，酶膜使用5次，離心分離機(jī)，蒸發(fā)濃縮罐，蒸發(fā)能力200 kg/h，噴霧干燥塔SUS 304水分蒸發(fā)5 kg/h。

1.3 鈍化全脂新鮮米糠

利用雙螺桿擠壓膨化機(jī)擠壓，機(jī)筒溫度130℃、螺桿轉(zhuǎn)速160 r/min、模頭孔徑8 mm，對(duì)新鮮全脂米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理，得到鈍化全脂新鮮米糠。

1.4 鈍化全脂新鮮米糠的酶法提油

按照一定液料比添加水，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)料液pH 4.0～8.0。料液溫度為35～55℃時(shí)，添加一定量的酶，酶解2～6 h，酶解過程中保持混合液pH不變并不斷攪拌，使物料充分被酶解。分離游離油和乳狀液，將乳狀液加熱到95℃破乳分離，合并油項(xiàng)[7]。

1.5 米糠酶解物的糖化酶解

水酶法提油后的余下物質(zhì)稱為米糠酶解物，通過調(diào)整pH，加入一定量的糖酶，在一定溫度、時(shí)間條件下，糖化米糠酶解物中的糖類物質(zhì)，調(diào)整pH后離心分離，經(jīng)濃縮噴霧干燥，得到米糠蛋白多肽。

1.6 脂肪酶活性測(cè)定

參考Laokuldilok[8]的方法。以p-NPL為底物，將適量酶液加入相應(yīng)底物溶液中，混合物在35℃的振蕩水浴中孵育20 min。通過煮沸5 min終止反應(yīng)。離心后（臺(tái)式離心機(jī)，6 000 r/min，10 min），在410 nm處測(cè)量澄清上清液的吸光度。一個(gè)單位（U）的酶活性被定義為在測(cè)定條件下每分鐘釋放1 000 PnP所需的酶量。

1.7 總糖測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法[9]測(cè)定米糠中的總糖含量。用分析天平稱量0.200 0蒽酮，加80%硫酸溶液溶解后置于容量瓶中定容。將樣品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于具塞試管中，加入蒽酮-硫酸溶液反應(yīng)，以去離子水為空白對(duì)照，在500～900 nm范圍內(nèi)測(cè)定其吸光度值。

1.8 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用分子篩層析法確定米糠多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。將米糠蛋白肽溶液進(jìn)行稀釋，搖勻待用；制備標(biāo)準(zhǔn)多糖溶液和藍(lán)色聚多糖溶液。用Sephade?xG-200填柱，待凝膠柱平衡后加入樣品。當(dāng)藍(lán)色物質(zhì)流出時(shí)，開始收集洗脫液。洗脫液進(jìn)行稀釋后，在490 nm下測(cè)吸光度代表標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的吸光度；在280 nm下吸光度值代表蛋白質(zhì)的吸光度，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖和米糠蛋白多肽的出峰位置計(jì)算蛋白質(zhì)分子量。

1.9 水解度測(cè)定（DH）

采用 pH-stat法[10]。

式中，B為NaOH所用體積（mL）；N為NaOH濃度（mol/L）；MP為原料中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；α為氨基酸平均解離常數(shù)；htot為每克原料蛋白質(zhì)中含有肽鍵毫摩爾數(shù)。

1.10 蛋白質(zhì)回收率計(jì)算

蛋白質(zhì)回收量測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)。

式中，m為上清液中蛋白質(zhì)回收量（g）；M為蛋白質(zhì)總量（g）。

1.11 蛋白酶酶活

采用Folin-酚法，采用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。取1 mL樣品溶液（約含20～250 μg多肽或蛋白質(zhì)），加入5 mL氫氧化銅溶液，混勻，于20～25℃放置10 min，再加入0.5 mL試劑乙（Folin氏試劑），立即振蕩搖勻，在20～25℃保溫30 min，然后于500 nm處比色。以1 mL水代替樣品作為空白對(duì)照。

1.12 提油率

本試驗(yàn)將提油率定義為采用水酶法提取的游離油質(zhì)量之和與米糠質(zhì)量的百分比（%，g/g）。

1.13 油脂品質(zhì)測(cè)定

酸值A(chǔ)V：參照GB/T 5530-2005測(cè)定；過氧化值PV：參照GB/T 5538-2005測(cè)定；

皂化值SV：參照GB T 5534-2008測(cè)定；碘值IV：參照GB/T 13892-2012；折光指數(shù)RI：參照GB/T 5527-2010。

1.14 蛋白質(zhì)分散指數(shù)測(cè)定

蛋白質(zhì)分散指數(shù)是一項(xiàng)衡量食物蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的指標(biāo)，為蛋白質(zhì)中能在水中分散的蛋白質(zhì)量占該蛋白質(zhì)總量的百分比（%）。

1.15 谷維素測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱量0.020 8 g γ-谷維素，加入適量三氯乙烷進(jìn)行溶解，用正己烷定容容量瓶中。標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度分別為4.16、8.32、12.48、6.64、20.80 μg/mL，最大吸收波長315 nm。樣品測(cè)定：取一定量分散均勻的AEE，加入二倍體積正己烷，于50℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中萃取90 min，315 nm處測(cè)定上層正己烷吸光度，以正己烷為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠的特性

米糠經(jīng)過40目篩去除原料米糠中的米粞，新鮮米糠感官指標(biāo)性狀如1表所示。

表1 新鮮米糠感官性狀

擠壓膨化米糠：膨化機(jī)筒溫度130℃、螺桿轉(zhuǎn)速160 r/min、模頭孔徑8 mm，出料溫度為90℃，新鮮米糠質(zhì)量及鈍化全脂新鮮米糠特性見表2所示。

表2 新鮮米糠質(zhì)量及鈍化全脂新鮮米糠特性 %

通過雙螺桿擠壓膨化后，鈍化全脂新鮮米糠脂肪酶殘余活力降至3.84%，由于米糠脂肪酶的活性已被鈍化，杜絕了后續(xù)酶解過程中脂肪酶的酶解，減少了對(duì)外加酶的干擾因素。同時(shí)擠壓膨化處理，對(duì)米糠中的淀粉含量由19.67%，降到了15.38%，擠壓膨化處理對(duì)米糠淀粉的影響見表3。

表3中直鏈淀粉含量基本沒有發(fā)生變化，支鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)則下降了51%，且糊化度明顯提高，表明擠壓膨化機(jī)的高溫、高剪切作用劇烈地破壞了淀粉原有的晶體結(jié)構(gòu)，淀粉分子重新排列，由致密結(jié)構(gòu)向疏松結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，有助于后續(xù)的酶法提取油脂和蛋白。

2.2 米糠的酶法提油

在堿性蛋白酶、纖維素酶組成的復(fù)合酶（1∶1，w/w）添加量2%、酶解時(shí)間5 h、酶解溫度50℃、液料比5∶1、pH 6.0的條件下，對(duì)鈍化全脂新鮮米糠進(jìn)行酶解，經(jīng)離心分離得到稻米油的質(zhì)量見表4。

表4 稻米油物理化學(xué)性質(zhì)

表4中鈍化新鮮米糠制備的稻米油AV僅為7.45±0.31，說明擠壓膨化極大地鈍化了米糠中的脂肪酶活性，破壞脂肪層的結(jié)構(gòu)，提高了稻米油的品質(zhì)和貯存的穩(wěn)定性。一般情況膨化機(jī)出料段膨化腔溫度在120～130℃下，既可以使米糠中的脂肪酶、過氧化酶有效失活，又能使米糠中天然抗氧化物質(zhì)減少，從而使米糠保鮮期延長，也為后續(xù)加工提供了優(yōu)質(zhì)原油，提油率可達(dá)到23.27%。

2.3 米糠酶解物的糖化酶解

將米糠酶解物溶液pH調(diào)至3.5，糖化酶的添加量為0.3%，酶解溫度60℃，酶解1.5 h，溶液pH調(diào)至4.5，離心分離得到米糠蛋白多肽液，其中總糖含量僅為35.56 mg/g，占3.56%，與使用米糠蛋白粉制備蛋白肽液中總糖含量相當(dāng)，說明添加糖酶后總糖去除效果明顯。

將米糠蛋白多肽液濃縮，噴霧干燥，得到米糠蛋白多肽，通過分子篩層析確定多肽的分子質(zhì)量，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 米糠多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布 %

由表6可得，在蛋白酶最適條件下進(jìn)行水解，DH為21.04%，蛋白質(zhì)回收率為80.13%，實(shí)現(xiàn)了米糠的高值化利用。且米糠多肽PDI達(dá)到78.5%、NSI為68.6%，說明在前期擠壓膨化過程中米糠蛋白保存率較高，酶解后蛋白質(zhì)分散較為均一，制備了品質(zhì)優(yōu)良的蛋白多肽。

表6 米糠蛋白多肽特性 %

3 結(jié)論

以全脂鈍化新鮮米糠為原料，通過酶解同時(shí)制得營養(yǎng)豐富的稻米油及米糠蛋白多肽，操作步驟簡便，避免了傳統(tǒng)的強(qiáng)堿對(duì)蛋白質(zhì)的變性破壞，減少了蛋白質(zhì)提取過程中過多鹽雜質(zhì)的進(jìn)入。通過添加糖化酶，降低了水溶性糖類雜質(zhì)在蛋白產(chǎn)品中的含量，通過生物酶法，同時(shí)提取稻米油及米糠蛋白多肽，實(shí)現(xiàn)了米糠高值化利用。