液-液微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法測定白酒中15種塑化劑含量

魏泉增，王婧楠，王媛媛，龔玉萃，孫軍濤

（1.許昌學(xué)院 河南省食品安全生物標識快檢技術(shù)重點實驗室，河南 許昌 461000；2.許昌學(xué)院 國際教育學(xué)院，河南 許昌 461000）

隨著人們生活水平的提升，白酒成為餐桌上很多見的飲品，但白酒塑化劑超標問題卻層出不窮。塑化劑是一種無色無味的液體高分子材料助劑[1]，它能有效使產(chǎn)品的柔韌性和可塑性增高[2]。塑化劑種類很多，白酒中的塑化劑主要指鄰苯二甲酸酯類化合物（phthalic，PAEs），由于它易溶于乙醇，因此在白酒釀造、貯存、運輸和包裝的過程中，很容易發(fā)生塑化劑的遷移[3]，主要是通過塑料容納器具及塑料流通管路等方式溶解入白酒中[4-5]。其遷移量與時間具有相關(guān)性，時間越長白酒中的塑化劑殘留量就越多[6]，這就是白酒中存在塑化劑的最主要的原因。

雖然塑化劑的急性毒性不強，但現(xiàn)在已有研究表明塑化劑具有多種慢性毒性。假如長時間飲用塑化劑超標的白酒，鄰苯二甲酸酯類化合物在人體內(nèi)會被腸道、腹腔和肺吸收，并可以穿透皮膚。由于塑化劑化合物與激素的分子結(jié)構(gòu)相似，因此有“環(huán)境雌激素”的別稱[7]。另外，塑化劑會干擾人體分泌系統(tǒng)，致使女性性早熟、男性生殖能力削弱[8]，長期在體內(nèi)會損害人體神經(jīng)系統(tǒng)，提高致癌、致畸的風(fēng)險[9]。為了減少塑化劑損害人體健康事件的發(fā)生率，檢測分析與控制白酒中的塑化劑就至關(guān)重要。

目前塑化劑的檢測方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[10]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11]、氣質(zhì)聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-13]、液質(zhì)聯(lián)用法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）[14]，免疫檢測法[15]、離子遷移譜（ion mobility spectroscopy，IMS）[16]、薄層色譜法（thinlayerchromatography，TLC）等方法。徐皓等[17]采用GC-MS和HPLC兩種方法檢測白酒中塑化劑。但對于不同香型白酒塑化劑差異分析研究較少。輔助表面活性劑強化乳化液-液微萃取技術(shù)[18]，具有小體積有機溶劑會使有機相中被測物質(zhì)的濃度大大提高，從而溶劑量也大大減少，又因其快速、簡單、成本低的優(yōu)點[19-20]，對快速檢測不同香型白酒中塑化劑含量差異的測定提供保障。

采用表面活性劑強化乳化液-液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定白酒中鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（bis（2-methoxyethyl）phthalate，DMEP）、鄰苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（bis（4-methyl-2-pentyl）phthalate，BMPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（bis（2-ethoxyethyl）phthalate，DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（dipentylphthalate，DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（dihexyl phthalate，DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（benzylbutyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（bis（2-n-butoxyethyl）phthalate，DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP）15種塑化劑的含量，并對塑化劑含量進行相關(guān)性分析，以期對控制白酒中塑化劑的含量提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒樣品均為市售白酒，具體香型見表1。

表1 白酒樣品及其香型Table 1 Baijiu sample and their type of flavor

15種鄰苯二甲酸酯混合標準儲備液（100 μg/mL）：美國AccuStandard公司；四氯乙烯：天津傲然精細化工研究所；吐溫-20：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙酮、氯化鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超純水：Millipore Simplicity超純水系統(tǒng)：上海彤迪科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技公司；CTC多功能氣相色譜自動進樣器PAL RSI：瑞士思特斯分析儀器有限公司；YP20002電子天平：上海衡際科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS臺式低速自動平衡離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

提取白酒中塑化劑采用表面活性劑強化乳化液-液微萃取的方法[21]。吸取4 mL用高純水稀釋成酒精度為15%vol左右的白酒樣品至15 mL錐形玻璃離心管中，加入1.12 g氯化鈉至飽和，而后加入400 μL四氯乙烯和100 μL 2.0 mmol/L吐溫-20，強烈混合30 s，在1 500 r/min條件下離心10 min，吸取四氯乙烯相，進行GC-MS分析。

1.3.2 色譜條件

安捷倫HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min，再以2 ℃/min升溫至280℃，保持7.5min；進樣口溫度：260℃；進樣量：1μL；不分流進樣；載氣：高純氦（純度＞99.999%），流速1.0mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；溶劑延遲7.0 min；四級桿溫度：150 ℃；多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描類型：dMRM。

1.3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

碰撞能量的優(yōu)化及產(chǎn)物離子的選擇。分別以碰撞能量為5 eV、10 eV、15 eV、20 eV、25 eV、30 eV、35 eV、40 eV對母離子進行產(chǎn)物離子掃描，比較碰撞能量下產(chǎn)物離子的豐度強度，確定碰撞能量、母離子和子離子。

1.3.5 標準溶液的制備

將100 μg/mL的15種鄰苯二甲酸酯混合標準儲備液用丙酮稀釋成5 μg/mL、1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.04 μg/mL、0.008 μg/mL的標準系列溶液，進行標準曲線繪制。

1.3.6 精密度試驗

同一標準溶液分析6次，測定塑化劑的含量，計算測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），檢測儀器精密度。

1.3.7 重復(fù)性試驗

加標后15%vol左右的乙醇水溶液，測定塑化劑含量，重復(fù)6次，計算測定結(jié)果的RSD值，考察其重復(fù)性。

1.3.8 加標回收試驗

取4 mL 15%vol的乙醇溶液，分別加入的混合標準儲備液，使總質(zhì)量濃度達到0.010 μg/mL、0.050 μg/mL，按照樣品前處理方法制備樣品溶液，并按GC-MS儀器條件進樣測定，各加標量平行測定3份，計算回收率及RSD值。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

運用PAST軟件，采用Correlation模型對32份不同白酒中的15種塑化劑進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。采用Minitable 17軟件分析白酒中15種塑化劑含量之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 15種塑化劑提取離子流圖

15種塑化劑dMRM提取離子流圖見圖1。如圖1所示，15種塑化劑分離良好，15種塑化劑的色譜出峰順序為DMP、DEP、DIBP、DBP、DMEP、BMPP、DEEP、DPP、DHXP、BBP、DBEP、DCHP、DPhP、DNOP、DNP。白酒中15種塑化劑的保留時間、母離子、子離子及其相對豐度見表2。豐度最高離子對作為定量離子，其余作為定性離子。

圖1 15種塑化劑GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of 15 kinds of plasticizers analysis by GC-MS

表2 多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 2 Parameters of multistage reaction monitoring

續(xù)表

2.2 標準曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

將系列標準混合溶液繪制標準曲線擬合曲線，其線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。由表3可知，15種塑化劑的相關(guān)系數(shù)（R2）≥0.950，線性范圍是0.008～5μg/mL，檢出限范圍在1.44×10-6～1.50×10-6mg/mL。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)各組分線性關(guān)系良好。

表3 白酒中15種塑化劑標準曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 3 Regression equation,correlation coefficient,linearity range and limits of detection of 15 kinds of plasticizers

2.3 精密度試驗

按照同一標準溶液平行測定6次，考察方法精密度，結(jié)果見表4。由表4可知，測定15種塑化劑的方法精密度試驗結(jié)果RSD范圍為0.75%～2.53%。從總體上來看，儀器穩(wěn)定、精密度良好，可以進行樣品分析。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision tests

2.4 重復(fù)性試驗

測定加標后15%vol左右的乙醇水溶液中的塑化劑含量，重復(fù)6次，計算RSD值，結(jié)果如表5所示，15種塑化劑含量測定結(jié)果的RSD范圍為1.4%～3.6%，表明此方法重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 Results of repeatability tests

2.5 加標回收率試驗

取4 mL體積分數(shù)60%的乙醇溶液，分別加入混合標準儲備液，終質(zhì)量濃度為0.010 μg/mL、0.050 μg/mL，測定塑化劑含量，計算回收率及RSD值，見表6。由表6可知，加標回收率在89.70%～117.73%之間，加標回收率試驗結(jié)果RSD值為1.71%～6.82%，表明回收率滿足試驗要求。

表6 加標回收率試驗結(jié)果Table 6 Results of recoveries tests

續(xù)表

2.6 測定32份不同品牌的白酒樣品中塑化劑的濃度

國家衛(wèi)生健康委員會從健康角度出發(fā)對白酒中塑化劑含量進行風(fēng)險評估，結(jié)果表明DBP的最大殘留量為1.0mg/kg，DEHP的最大殘留量為5.0 mg/kg[17]，只有塑化劑含量比最大殘留量低時，飲酒者的健康風(fēng)險才較低[22]。這就表明白酒產(chǎn)品中的DBP和DEHP含量處于最大殘留量之下，通常對飲酒者來說不會對健康有損害。測定市售的32份不同品牌白酒樣品中的塑化劑濃度，結(jié)果見表7。由表7可知，白酒樣品中DBP含量低于規(guī)定的最大殘留量，未超標，醬香型白酒相比其他香型白酒的塑化劑含量要低，而清香型白酒所含塑化劑大多比其他香型白酒高。濃香型白酒檢測出的塑化劑數(shù)量最多，清香型白酒檢測出的塑化劑數(shù)量最少。

表7 白酒樣品的塑化劑含量Fig.7 Plasticizer contents in Baijiu samples

續(xù)表

對32份白酒樣品檢測分析，其檢出率及檢出值范圍見表8。結(jié)果表明，32份白酒樣品中的15種塑化劑均能檢出，其中DMP、DEP、DIBP、DBP、BMPP、DPP、DHXP、BBP、DCHP這9種塑化劑的檢出率均大于70%，其中DEP的檢出率高達100%。DBP檢出值范圍最大，為0.001～0.735 μg/mL，DBEP、DNP僅在17號樣品中被檢出，檢出率相對較低。

表8 32種白酒中塑化劑分析結(jié)果Fig.8 Analysis results of plasticizers from 32 kinds of Baijiu

2.7 數(shù)據(jù)分析

2.7.1 主成分分析

主成分分析是一種實用的統(tǒng)計分析方法，通過降維技術(shù)把多個變量轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)幾個主成分，是解決存有多變量，并且變量間有著一定關(guān)系的一種有用方法[23-25]。運用PAST軟件，采用Correlation模型對32份不同白酒中的15種塑化劑進行主成分分析，從中獲得的主成分是原始變量之間的線性組合，可以最大限度地說明原始變量包含的信息，簡化之前的多維問題。主成分的方差貢獻率、特征值和累計方差貢獻率見表9。

表9 主成分特征值和方差貢獻率Fig.9 Eigenvalue and variance contribution rates of principal components

當(dāng)累積方差貢獻率＞80%且特征值＞1時，可以用主成分代表原始數(shù)據(jù)，因此選前6個主成分（累計貢獻率84.170%）代替原來的15個塑化劑成分進行分析，不僅能達到降維的目的，而且保留了數(shù)據(jù)的大多數(shù)信息。以15種塑化劑的第一主成分為橫坐標、第二主成分為縱坐標作主成分分析圖見圖2。

圖2 塑化劑成分主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis of plasticizer components

由圖2可知，大部分白酒分布在第三象限，位置越接近的樣品中塑化劑成分越相似，但不同香型、產(chǎn)地的白酒不能區(qū)別開，存在交叉現(xiàn)象，這表明塑化劑含量與香型相關(guān)性不顯著，可能與地域因素、環(huán)境因素有關(guān)，致使所含塑化劑的種類及含量不盡相同。

2.7.2 樣品中塑化劑含量的相關(guān)性分析

使用Minitable17軟件分析白酒中15種塑化劑之間的相關(guān)性，P＜0.01則表示顯著相關(guān)，結(jié)果見表10。由表10可知，DBP與DIBP顯著相關(guān)；DEEP與DMEP、DEP顯著相關(guān)（P＜0.01）；DPP與BMPP之間具有顯著相關(guān)性（P＜0.01）；DBEP與DEEP、DMEP顯著相關(guān)；DCHP與DIBP顯著相關(guān)（P＜0.01）；DPhP與DMEP、DEEP、DHXP、DBEP顯著相關(guān)（P＜0.01）；DNOP與DMP之間具有顯著相關(guān)性；DNP與DMEP、DEEP、DBEP、DPhP顯著相關(guān)（P＜0.01）；其中，DPhP與DHXP是負相關(guān)，其余顯著相關(guān)的塑化劑都為正相關(guān)，而其余塑化劑之間相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

表10 白酒中塑化劑之間的相關(guān)性Table 10 Correlation between components of the plasticizers in Baijiu

3 結(jié)論

采用表面活性劑強化乳化液-液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定32份不同白酒樣品中的15種塑化劑含量。結(jié)果表明，該方法精密度RSD均＜2.53%，重復(fù)性RSD都＜3.6%，重復(fù)性、精密度良好，準確度較高。加標回收率為89.7%～117.73%，RSD值為1.71%～6.82%。32份不同品牌的白酒樣品中15種塑化劑含量分別為：DMEP、BMPP、DEEP、DPP、DHXP、BBP、DBEP、DPhP、DNOP、DNP的質(zhì)量濃度范圍為0.000 72～0.007 09 μg/mL；DMP、DEP、DIBP、DBP、DCHP的質(zhì)量濃度范圍為0.000 78～0.735 μg/mL。32份樣品中均能檢測到塑化劑，其中DMP、DEP、DIBP、DBP、BMPP、DPP、DHXP、BBP、DCHP這9種塑化劑的檢出率均＞70%，相關(guān)性分析表明，DEEP與DMEP極顯著相關(guān)（P＜0.01）；DPP與BMPP之間具有極顯著相關(guān)性（P＜0.01）；DCHP與DIBP極顯著相關(guān)（P＜0.01）；DPhP與DMEP、DEEP、DBEP極顯著相關(guān)（P＜0.01）；DNP與DMEP、DEEP、DBEP、DPhP極顯著相關(guān)（P＜0.01）。PCA分析結(jié)果表明，白酒中塑化劑含量與香型相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。這為白酒企業(yè)控制塑化劑含量提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。