產(chǎn)香酵母的分離鑒定及對不同原料釀造甜酒香氣成分的影響

楊玉蓉，鐘海雁，徐帥哲，楊 寧，楊 濤*

（中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

甜酒又稱甜酒釀、醪糟等，甜酒具有看起來像米、盛起來像飯、喝起來像酒、滋味如蜜的特點[1]，不僅可以直接飲用，也可用于發(fā)酵食品如饅頭[2]、米發(fā)糕[3]等的制作。非釀酒酵母可用以提高酒的風味，尤其是提高揮發(fā)性香味物質(zhì)的種類和含量，例如在葡萄酒風味提高研究中，具有高產(chǎn)酯能力的鐵紅假絲酵母（Candida pulcherrima）已經(jīng)是一種商業(yè)化的產(chǎn)香酵母[4]，貝酵母（Saccharomyces bayanus）用于增加蘋果白蘭地揮發(fā)性風味物質(zhì)含量，起到酒體增香的作用[5]，扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）發(fā)酵能提高韓國米酒乙酯類芳香化合物的含量[6]，為提高傳統(tǒng)米酒的香氣品質(zhì)，有研究表明從中國傳統(tǒng)甜酒曲中分離出的光滑假絲酵母（Candida glabrata）發(fā)酵后，具有豐富的酯類物質(zhì)及較高的含量[7]，可見目前越來越多的研究關注到產(chǎn)香產(chǎn)酯酵母的菌種開發(fā)。

米酒中有幾十上百種風味物質(zhì)，原料對風味物質(zhì)的形成具有一定決定作用，稻米中含量最多的成分是淀粉，淀粉含量平均達60%以上[8]。大米中含量第二多的物質(zhì)是蛋白質(zhì)，未經(jīng)研磨的糙米蛋白質(zhì)含量在7.1%～8.3%之間，精米中的蛋白質(zhì)含量在6.3%～7.1%之間[9]。大米蛋白含量對米酒風味的形成起著關鍵的作用，這是因為根霉在米酒釀造過程中除了起到液化和糖化的作用，還起一個非常重要的作用——產(chǎn)蛋白酶，根霉所產(chǎn)的蛋白酶酶解大米蛋白后形成小分子的多肽和氨基酸，有利于提高米酒的營養(yǎng)價值和風味[10]。

“曲為酒之骨”，甜酒曲是釀造優(yōu)質(zhì)甜酒的關鍵。但目前傳統(tǒng)甜酒曲多為家庭作坊手工制作，開放式培養(yǎng)，受氣候溫度的影響大，同時存在雜菌如致病菌的污染問題[11]，導致甜酒成品質(zhì)量不穩(wěn)定、存在安全隱患；商品化甜酒曲釀造的甜酒成品質(zhì)量穩(wěn)定，但酒香不足，甜度過高，多喝使人生膩。因此，為提高甜酒風味品質(zhì)，本研究從傳統(tǒng)顆粒酒曲中分離篩選產(chǎn)香酵母，結合形態(tài)學觀察及分子生物學對篩選菌株進行鑒定，采用頂空-氣相色譜（head spacegas chromatography，HS-GC）法對篩選菌株產(chǎn)香能力進行測定，并考察產(chǎn)香酵母對不同原料釀造甜酒香氣成分的影響，旨在為甜酒釀造篩選產(chǎn)香菌株和優(yōu)良原料，以提高甜酒風味品質(zhì)，為風味米酒開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株和原料

傳統(tǒng)顆粒甜酒曲：廣西梧州農(nóng)戶；米根霉（Rhizopus oryzae）MT835118：本實驗室保存；秈米（蛋白質(zhì)含量7.2 g/100g、碳水化合物含量75 g/100 g、脂肪含量0.6 g/100g）：湖南洞庭春米業(yè)有限公司；秈糯米（蛋白質(zhì)含量7.3 g/100 g、碳水化合物含量77.0 g/100 g、脂肪含量1.7 g/100 g）：安徽燕之坊食品有限公司。

1.1.2 化學試劑

乙酸乙酯（純度99.9%）、苯乙醇（純度99.5%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸苯乙酯（純度99%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙醇（純度99.7%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；Ezup Column Fungi Genomic 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；高溫α-淀粉酶（酶活40 000 U/g）、葡萄糖淀粉酶（酶活100000U/g）：北京索萊寶科技有限公司；TaqPlus DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium，PDA）：上海博微生物科技有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

米汁培養(yǎng)基：稱取100 g大米，蒸熟后加入0.3 g的高溫α-淀粉酶，90 ℃水浴鍋中液化1.5 h，100 ℃滅活10 min，再加入0.1 g葡萄糖淀粉酶，60 ℃水浴鍋中糖化1.5 h，4層紗布過濾，8 000 r/min離心10 min后，于121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

HS-10頂空進樣器、NexisGC-2030氣相色譜儀、SH-Rtx-1色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：日本島津公司；BA200顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；MIR-150A恒溫培養(yǎng)箱：上海SANTN公司；TD5A-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司、UV-2600紫外可見光分光光度計：日本島津公司、DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；Verity96well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；手持折光儀：艾普計量儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離和純化

將0.1 g酒曲加入到10 mL無菌水中梯度稀釋后，涂布于孟加拉紅瓊脂平板上，30 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h，挑取符合酵母菌落形態(tài)的單菌落，采用平板劃線法接種于YPD培養(yǎng)基，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，以上步驟重復3次，純化后得到純菌株。

1.3.2 分離菌株復篩

將篩選菌株置于米汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，采用HS-GC法測定甜酒典型風味β-苯乙醇含量，從而篩選產(chǎn)香能力最好的菌株。

各取一環(huán)分離菌株接種于50 mLYPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)至菌懸液的OD600nm值至1后，于米汁培養(yǎng)基中添加OD600nm值為1的各實驗菌株菌懸液0.8%（V/V），30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)72 h后，取發(fā)酵液用0.45 μm微孔濾膜過濾，1 mL濾液加入0.5 g NaCl后進樣檢測。

1.3.3 篩選菌株的鑒定

（1）形態(tài)學觀察

取一環(huán)純化后的菌，在YPD平板上平板劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察平板上單菌落的菌株菌落形態(tài)。用接種針沾取菌苔于載玻片上，滴加1滴無菌水，蓋上蓋玻片，于光學顯微鏡下10×40倍觀察菌株細胞形態(tài)。

（2）分子生物學鑒定

DNA提?。喊碋zup Column Fungi Genomic DNA Purification Kit說明進行DNA提取，DNA提取液于-20 ℃保藏備用。通過PCR擴增菌株的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)域序列，引物為通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；或者26S rRNA D1/D2區(qū)，擴增常用通用引物為NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。

PCR擴增體系：2 μL 的20～50 ng/μL模板DNA，2 μL 的10 μmol/L ITS1或NL1，2 μL 的10 μmol/L ITS4或NL4，2 μL的10 μmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），0.5 μL的5 U/LTaqPlus DNA聚合酶，加入超純水補至50 μL。PCR擴增條件如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸2 min。取5 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗其純度，電泳參數(shù)為150 V，100 mA，20 min。目的片段由生工生物工程（上海）股份有限公司進行一代測序，測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中，用基于局部比對算法搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行基因序列的同源性檢索，通過與已知酵母菌的基因序列比對進行分類鑒定。若基因序列與已知菌種的基因序列堿基差異大于1%，則該菌株即為新菌種。采用ClustalW比對ITS序列，利用MEGAX軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法（Bootstrap值設為1 000）構建系統(tǒng)發(fā)育。

1.3.5 米粉曲制作

取一環(huán)米根霉接種于PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)至孢子成熟，再用0.05%的Tween-80沖洗培養(yǎng)基表面，洗下的孢子經(jīng)2層無菌擦鏡紙過濾，將得到孢子懸液濃度調(diào)至約107CFU/mL。菌株YRNN5接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h，稀釋后得約107CFU/mL的菌懸液。將大米磨粉過60目篩得到大米粉，取50 g大米粉分別加入3個500mL三角瓶中，115℃滅菌30 min，按米粉質(zhì)量的2%將兩種菌懸液分別按米粉質(zhì)量2%的添加量加入滅菌后的米粉中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，于35 ℃烘箱中干燥3 d，使水分含量低至14%以下，得到米根霉、菌株YRNN5的米粉曲，用于甜酒發(fā)酵。

1.3.6 菌株YRNN5發(fā)酵秈米酒、糯米甜酒分析檢測

各取40 g秈米和秈糯米，按1∶1.4（g∶mL）的比例加入無菌水，于115 ℃蒸煮30 min，得到秈米和秈糯米米飯。將根霉和YRNN5米粉曲分別按接種量0.8%接至無菌秈米和秈糯米米飯中，總米粉曲接種量為1.6%，于30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵72 h，采用頂空氣相色譜聯(lián)用（HS-GC）法測定秈米和秈糯米甜酒關鍵香氣物質(zhì)（β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯）差異。

HS-GC分析條件為：SH-Rtx-1色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），頂空加熱條件為：恒溫爐溫度60 ℃，恒溫時間22 min；進樣口溫度220 ℃，分流進樣，分流比1∶20，載氣為氮氣（N2），流量1 mL/min；升溫程序：35 ℃保持6 min，以5 ℃/min升溫至50 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速度升至160 ℃；檢測器溫度220 ℃。

β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準曲線繪制：用體積分數(shù)為10%的乙醇溶液配制不同質(zhì)量濃度的β-苯乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準溶液，同時配制不同體積分數(shù)的乙醇溶液，分別以β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標繪制β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯標準曲線，β-苯乙醇標準曲線回歸方程為：y=34.33x-246.104，相關系數(shù)R2=0.997。得到乙醇標準曲線回歸方程為：y=3 821 829x+451 505，相關系數(shù)R2=0.999 2；乙酸乙酯標準曲線回歸方程為：y=1 497.95x-5 155.75，相關系數(shù)R2=0.999 8；乙酸苯乙酯標準曲線回歸方程為：y=156.88x-95.35，相關系數(shù)R2=0.999。按照標準曲線回歸方程計算發(fā)酵液β-苯乙醇、乙醇、乙酸乙酯和乙酸苯乙酯的含量。

糖度的測定采用手持糖度計測定，取兩滴甜酒發(fā)酵液滴于檢測的折光棱鏡表面，將折光儀對準光源觀察目鏡，所視分界線所對應的刻度值即為所測溶液的糖度（°Bx）。

感官評價：參考國標GB/T 12313—1990《感官分析方法風味剖面檢驗》[12]加以修改，具體為采用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法，標度方法為線性標度法。左端代表“最弱”，右端代表“最強”，由6名本實驗室（20～27歲，3名女性，3名男性）經(jīng)過訓練的人員組成感官評價小組。發(fā)酵后的秈米和秈糯米甜酒各取5 g于品酒杯中，樣品溫度和室溫均在20～25 ℃，評價完成后，用直尺測量氣味描述的線性表度長度，采用得到的長度數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 20.0軟件，繪圖采用Prism 8.0軟件，系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA X軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和純化

分離純化后得到純菌株6株，菌株分別命名為YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4、YRNN5、YRJM。

2.2 菌株復篩結果

β-苯乙醇是米酒的典型香氣物質(zhì)之一，具有典型的玫瑰花香[13]，賦予米酒花香的特征。篩選菌株產(chǎn)β-苯乙醇能力測定結果見圖1。由圖1可知，篩選菌株在米汁培養(yǎng)基中發(fā)酵后，菌株YRNN5產(chǎn)β-苯乙醇量（19.06 mg/L）顯著高于其他5株酵母（P＜0.05），其次是菌株YRNN3，β-苯乙醇產(chǎn)量為11.74 mg/L，而其他菌株在米汁培養(yǎng)基中產(chǎn)β-苯乙醇的量均低于10 mg/L。因此，選取產(chǎn)香能力更強的菌株YRNN5作為甜酒增香酵母進行后續(xù)實驗。

圖1 篩選菌株產(chǎn)β-苯乙醇能力Fig.1 β-phenylethanol production ability of screened strain

2.3 菌種形態(tài)學鑒定

篩選菌株的菌落及細胞形態(tài)觀察結果見圖2。由圖2A可知，菌株YRNN1～YRNN5的菌落顏色為白色，菌落邊緣光滑無擴散，30 ℃培養(yǎng)48 h后菌落直徑為5 mm。由圖2B可知，菌株YRNN1～YRNN5具有兩種細胞形態(tài)類型，一種是單細胞酵母形態(tài)，另一種是菌絲狀酵母形態(tài)。菌株YRJM的細胞形態(tài)則呈現(xiàn)典型的釀酒酵母的卵圓形。該實驗結果與FARH M等[14]的研究結果類似，從不同Nuruk樣品中分離出的雙形態(tài)的酵母被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera），該菌主要用于韓國米酒的發(fā)酵。

圖2 篩選菌株的菌落（A）及細胞（B）形態(tài)Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of screened strains

2.4 分子生物學鑒定

26S rRNA D1/D2區(qū)域具有較高的變異率，可用于親緣關系較近的菌株之間的分類研究[15]。核糖體重復單元的ITS區(qū)具有受環(huán)境因素影響小、進化速度快的特點，在相同種的不同菌株間高度保守，而在不同種間的差異極大，通常是應用于屬及屬以下的真菌分類學[16]。使用BLAST對6株酵母的擴增產(chǎn)物測序得到序列與相關菌株的序列進行比較，結果見表1。

由表1可知，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5與S.fibuligeraADJ4、KJJ81和ATCC36309的親緣關系最近，且序列相似度達99%以上，菌株YRJM與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）RG15和RG20的序列相似度為100%。

表1 6株篩選菌BLAST比對結果Table 1 BLAST comparison results of 6 screened strains

為進一步可視化菌株與其相似菌株之間的親緣關系，采用MEGA X軟件構件6株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains YRNN1,YRNN2,YRNN3,YRNN4 and YRNN5

由圖3可知，菌株YRNN1、YRNN2、YRNN3、YRNN4和YRNN5被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsisfibuligera），NCBI登記號分別為MT831527、MT831528、MT831529、MT831530和MN809231。菌株YRJM的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，菌株YRJM與S.cerevisiaeRG15的bootstrap值為100，被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），NCBI登記號為MT830867。

圖4 菌株YRJM的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YRJM

2.5 秈米和秈糯米甜酒風味

以菌株YRNN5作為甜酒增香酵母分別發(fā)酵秈米和秈糯米，所得甜酒風味輪廓見圖5。由圖5可知，秈米和秈糯米的風味輪廓有明顯的區(qū)別，體現(xiàn)在秈糯米甜酒的甜滋味更為突出。秈米甜酒雖然甜滋味不夠突出，但花香、果香和蜜香得分更高，整體風味更為突出。

圖5 菌株YRNN5發(fā)酵秈米和秈糯米制備甜酒風味輪廓圖Fig.5 Flavor profile of indica rice and indica glutinous rice wine fermented by strain YRNN5

選取具有果香特征的乙酸乙酯[17]、具有舒適花香和蜜香特征的β-苯乙醇[18]和乙酸苯乙酯[19]作為風味物質(zhì)含量評價指標，經(jīng)HS-GC測定風味物質(zhì)含量，秈米和秈糯米甜酒風味物質(zhì)測定結果見表2。由表2可知，秈米甜酒和秈糯米甜酒的乙醇含量分別為15.15%vol和12.80%vol，無顯著性差異（P＞0.05）。乙酸乙酯含量差異不顯著（P＞0.05），但秈米甜酒的乙酸乙酯含量為70.42 mg/L，高于秈糯米甜酒的47.01 mg/L。這可能與秈米甜酒和秈糯米甜酒乙醇含量差異不顯著有關，因為乙酸乙酯主要是在醇乙?；D(zhuǎn)移酶的催化下由乙酸和乙醇脫水縮合形成[20]。秈米和秈糯米甜酒的β-苯乙醇含量分別為771.38 mg/L和433.07 mg/L，差異顯著（P＜0.05），秈米甜酒的β-苯乙醇含量高于秈糯米甜酒。該結果與油卉丹等[21-22]的研究結果類似。貴州和海南的地方標準[23-24]對發(fā)酵米酒中的β-苯乙醇都有最低含量標準（4～20 mg/mL）。秈米和秈糯米甜酒的乙酸苯乙酯含量也具有顯著性差異（P＜0.05），乙酸苯乙酯含量分別為2.90 mg/L和1.33 mg/L。乙酸苯乙酯可經(jīng)酯酶催化乙酸與β-苯乙醇形成，或是經(jīng)醇?；D(zhuǎn)移酶催化乙酰輔酶A和β-苯乙醇形成[25]，β-苯乙醇是乙酸苯乙酯形成的必要底物之一，因此秈米甜酒和秈糯米甜酒中乙酸苯乙酯含量的差異可能與β-苯乙醇含量高低有關。趙婷婷等[26]研究表明，β-苯乙醇和乙酸苯乙酯是米酒的主體香成分，通過測定典型甜酒香風味物質(zhì)乙酸乙酯、β-苯乙醇和乙酸苯乙酯含量和感官評價，表明秈米甜酒的風味要高于秈糯米甜酒。

表2 秈米和秈糯米甜酒關鍵風味物質(zhì)差異Table 2 Differences in key flavor compounds between sweet wine of indica rice and indica glutinous rice

3 結論

該研究本實驗從土曲中分離出6株酵母，其中5株菌（編號為YRNN1～YRNN5）被鑒定為扣囊復膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和菌株YRJM被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株YRNN5產(chǎn)β-苯乙醇最高（22.98 mg/L），將其作為甜酒增香菌株應用于不同原料釀造甜酒。甜酒香氣成分分析結果表明，秈米甜酒的β-苯乙醇和乙酸苯乙酯含量分別為771.38 mg/L、2.90 mg/L，顯著高于秈糯米甜酒（P＜0.05），秈米甜酒和秈糯米甜酒的乙醇含量分別為15.15%vol和12.80%vol，無顯著性差異（P＞0.05）。本研究篩選出的扣囊復膜酵母產(chǎn)β-苯乙醇能力優(yōu)于釀酒酵母，能提高甜酒的典型的蜜香和花香，秈米甜酒的整體風味優(yōu)于秈糯米甜酒，菌株YRNN5和秈米可以作為甜酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母和優(yōu)良原料。