鄰苯二甲酸二丁酯酶聯(lián)免疫分析方法的建立及鎮(zhèn)江地區(qū)水體污染調(diào)查研究

周軍+朱暖飛+邵啟運(yùn)+黃夢(mèng)璐+張禎+吳向陽

摘要：采用制備的鄰苯二甲酸二丁酯多克隆抗體建立可檢測(cè)環(huán)境水體中痕量鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫（ELISA）分析方法，對(duì)各種參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，在最優(yōu)條件下本方法具有較高的靈敏度（檢測(cè)限為 66.6 ng/mL）、較寬的檢測(cè)范圍（70～1 600 ng/mL）、較好的準(zhǔn)確度（回收率82.8%～104.0%）。利用此高通量分析方法對(duì)鎮(zhèn)江部分河流中水樣、底泥進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江市區(qū)幾處河流，DBP普遍檢出，水樣中DBP濃度為76.5～140.4 ng/mL，底泥中DBP濃度可達(dá)114.6～248.7 ng/g。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二丁酯；酶聯(lián)免疫；抗體；水體；鎮(zhèn)江

中圖分類號(hào)：X824文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0289-03

鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)（phthalateesters，PAEs）是一類大量應(yīng)用于塑料及一次性塑料消費(fèi)品（食品包裝材料、容器、醫(yī)療用品）的增塑劑，還可以作為原料用于香味劑、化妝品和冷凝劑，這類化合物的使用，造成了全球性的污染[1]。其中，鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）在被檢出的PAEs樣品中分布最為廣泛[2]，F(xiàn)atoki等對(duì)南非East London港中DBP濃度進(jìn)行了分析，其含量可達(dá)2.8～121.9 ng/mL[3]；Adeniyi等報(bào)道稱尼日利亞的河水中DBP的含量為202.5～270.5 ng/mL[4]；陸繼龍等對(duì)第二松花江中下游中DBP濃度進(jìn)行了測(cè)定，其平均濃度高達(dá)717.24 ng/mL[5]。同時(shí)，研究表明，DBP具有明顯的生殖毒性：可以引起染色體丟失或斷裂等畸變，阻礙正常精子的生成[6]；可導(dǎo)致雄性兔與大鼠生殖道畸形，睪丸萎縮，從而造成其生殖系統(tǒng)損傷[7]。因此，建立簡(jiǎn)單、快速高通量的分析方法，對(duì)水體中此類污染物進(jìn)行分析極其必要。DBP分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

目前報(bào)道的有關(guān)分析DBP的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、液相色譜法[9]、LC-MS/MS[10-11]等儀器方法，然而，由于這類方法存在測(cè)試成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)所需樣品量大（通常大于500 mL）及前處理步驟繁瑣等不足，無法在較大范圍內(nèi)系統(tǒng)、全面、快速分析環(huán)境水體中DBP的含量。與此相比，酶聯(lián)免疫法（ELISA）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、適合高通量分析的優(yōu)勢(shì)。因此，本研究利用自主制備的DBP多克隆抗體，建立了高靈敏的ELISA方法，優(yōu)化了影響方法靈敏度與準(zhǔn)確度的各種因素，并以此方法對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)部分小型淺水河流中DBP的污染狀況進(jìn)行了調(diào)查。

1材料和方法

1.1材料和試劑

DBP抗原抗體，由江蘇大學(xué)環(huán)境科學(xué)團(tuán)隊(duì)制備；鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸乙酯、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、四甲基聯(lián)胺，均購自美國(guó)Sigma公司；Tween-20、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、碳酸鈉（Na2CO3）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、濃硫酸（H2SO4）等，均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，且均為分析純；酶標(biāo)板，購自丹麥NUNC公司。

碳酸鹽包被緩沖液CB：0.05 mol/L、pH值為9.6；封閉液：含1%明膠的CB液；洗滌液PBST：0.01 mol/L、pH值為7.4、含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的PBS液；抗體稀釋液：0.01 mol/L、pH值為7.4、0.01% Tween-20、0.1%明膠的PBS液；顯色液：10 mg鄰苯二胺、25 mL檸檬酸鈉緩沖液、5 μL 30%過氧化氫，用時(shí)混合；終止液：2 mol/L H2SO4。

1.2儀器設(shè)備

電子分析天平，購自重慶CoiC公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海精密科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，購自美國(guó)Thermo公司。

1.3間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法（ic-ELISA）的建立

采用方陣滴定法，確定抗原最佳包被濃度、抗體最佳包被濃度，為達(dá)到最佳檢測(cè)條件，對(duì)孵育條件、封閉時(shí)間、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、二抗稀釋倍數(shù)、pH值、離子強(qiáng)度等影響因素進(jìn)行優(yōu)化。

具體ic-ELISA操作步驟為：（1）包被：用包被液將稀釋的包被原加至酶標(biāo)板，100 μL/孔，4 ℃過夜孵育；（2）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（3）封閉：加入150 μL/孔封閉液，37 ℃孵育1 h；（4）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用200 μL洗滌液洗1遍，在吸水紙上拍干；（5）加樣：每孔加入50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和適當(dāng)稀釋的待檢血清，37 ℃孵育30 min；（6）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗液洗3遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（7）加酶辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗：加入 100 μL/孔 HRP-羊抗兔IgG，37 ℃孵育 30 min；（8）洗滌：傾去孔內(nèi)液體，用洗液洗5遍，200 μL/孔，在吸水紙上拍干；（9）顯色：加入新鮮配制的TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色10 min；（10）終止：加入終止液，50 μL/孔；（11）測(cè)定：用酶標(biāo)儀讀取各孔D450 nm值。

1.4建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及數(shù)據(jù)分析

根據(jù)以上優(yōu)化的結(jié)果，按照“1.3”節(jié)中的方法建立DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以零標(biāo)準(zhǔn)品D450 nm值為B0值，相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品抑制時(shí)的D450 nm值為B值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以B/B0為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定10份空白樣，取測(cè)定平均值減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)曲線上其對(duì)應(yīng)的濃度值即為檢測(cè)限（limit of detection，LOD）。

1.5交叉反應(yīng)率的測(cè)定

選擇與鄰苯二甲酸二丁酯具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（benzyl butyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸單丁酯（monobutyl phthalate，MBP）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate，MEHP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）、鄰苯二甲酸二異辛酯[di（2-ethylhexyl）phthalate，DiOP]，測(cè)定得到各藥物的IC50值（抑制中點(diǎn)即抑制率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度），按公式（1）計(jì)算交叉反應(yīng)率。

[JZ（]交叉反應(yīng)率=DBP的 IC50值/相似結(jié)構(gòu)物的IC50值×100%。

1.6樣品前處理及添加回收率的測(cè)定

各取2 mL（或2 mg泥土，自然陰干）的樣品，加入4 mL正己烷，振蕩搖勻后使用高速離心機(jī)6 000 r/min離心 10 min，取上清，并用氮吹儀吹干。最終樣品用2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）復(fù)溶。

取空白樣本，添加一定體積的DBP標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)平行。將混合物在漩渦混合器上渦動(dòng)1 min，然后靜置 15 min。按建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定，檢測(cè)時(shí)每份樣品做3個(gè)平行重復(fù)孔。將各樣品測(cè)得的D450 nm值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的藥物濃度，并根據(jù)公式（2）計(jì)算回收率。

[JZ（]回收率=實(shí)測(cè)值/添加值×100%。

2結(jié)果與分析

2.1間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立與優(yōu)化

為達(dá)到最佳的檢測(cè)效果，本研究對(duì)影響方法的各種參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括抗原稀釋度、抗體稀釋度、孵育條件、封閉時(shí)間、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、HRP稀釋度、pH值、離子強(qiáng)度。在最優(yōu)條件下（部分?jǐn)?shù)據(jù)如表1所示），分別為：抗原稀釋度1 ∶[KG-*3]5 000、抗體稀釋度1 ∶[KG-*3]30 000、孵育條件4 ℃過夜、封閉時(shí)間1.5 h、一抗競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間30 min、HRP稀釋度1 ∶[KG-*3]2 000、pH值7.0、離子強(qiáng)度0.15 mol/L，以DBP濃度的LOG值為橫坐標(biāo)，抑制百分比（B/B0）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），其抑制程度與DBP的濃度具有明顯的線性關(guān)系（70～1 600 ng/mL），IC50值為421 ng/mL，檢測(cè)限可達(dá)66.6 ng/mL。

2.2交叉反應(yīng)率測(cè)定

在最佳反應(yīng)條件下，測(cè)定7種DBP的類似結(jié)構(gòu)物，其中對(duì)BBP的交叉反應(yīng)率為22.5%，對(duì)DEP的交叉反應(yīng)率為 1.08%，其余5種均小于0.01%，從而可推斷該檢測(cè)體系所用的DBP抗體具有較強(qiáng)的特異性。根據(jù)免疫學(xué)的基本原理[12]：抗體傾向于識(shí)別距離偶聯(lián)段最遠(yuǎn)的基團(tuán)（主導(dǎo)的抗原決定簇）。對(duì)于所測(cè)定的7種PAEs，只有BBP在距離偶聯(lián)段最遠(yuǎn)處，和DBP有相似的正丁基官能團(tuán)，而其他PAEs均無。

2.3樣本添加回收試驗(yàn)

[JP2]DBP在樣品中的添加回收率、變異系數(shù)如表2所示。結(jié)果表明，其添加回收率均值在82.8%～104.0%之間，變異系數(shù)均小于20%，顯示該方法的準(zhǔn)確度和精確度均符合檢測(cè)要求。

2.4鎮(zhèn)江市內(nèi)小型淺水河流水體和底泥的檢測(cè)

表3為鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流中DBP在水體、底泥中的含量。由表3可知，DBP作為一種常見增塑劑在環(huán)境水體中普遍存在。4條河流中，除玉帶河未檢測(cè)到（玉帶河離市區(qū)較遠(yuǎn)，且河道定期清淤，故水質(zhì)較好），其余3條河流水體中DBP的含量介于76.5～140.4 ng/mL之間，顯著高于臺(tái)灣河（1.0～13.5 ng/mL）[13]、意大利淡水（ND～0.028 ng/mL）[14]和加拿大False Creek港（9.32～63.9 ng/mL）[15]中DBP的含量，而且超過《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838—2002）中DBP的標(biāo)準(zhǔn)限值（3 ng/mL）[16]。顯然，DBP在3條市區(qū)河流中污染嚴(yán)重，這可能與河流周邊附近工業(yè)廢水的排放、固體廢棄物的堆放和雨水淋洗以及PVC塑料的緩慢釋放有關(guān)；另外下游的DBP含量明顯高于中游，可推斷出隨河流沿程增加，帶入水體中的污染物呈增加趨勢(shì)，導(dǎo)致DBP含量也隨之升高。

3結(jié)論

本研究建立了環(huán)境水體中DBP間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法。通過條件優(yōu)化，本方法的IC50值可達(dá)421 ng/mL，線性范圍為70～1 600 ng/mL，檢測(cè)限為66.6 ng/mL。同時(shí)，本方法具有較高的準(zhǔn)確度與精確度（回收率為82.8%～104.0%，變異系數(shù)為3.25%～10.20%）。利用此方法對(duì)鎮(zhèn)江市部分小型淺水河流進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明市區(qū)內(nèi)水體中DBP污染較為嚴(yán)重。本研究為DBP在鎮(zhèn)江區(qū)域的污染狀況調(diào)查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一定的技術(shù)支持。

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