我國咖啡炭疽病菌致病力分化

陸 英，賀春萍，吳偉懷，梁艷瓊，鄭金龍，黃 興，習(xí)金根，譚施北，易克賢

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶農(nóng)林有害生物入侵檢測與控制重點開放實驗室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物檢測監(jiān)控重點實驗室 海南 ?？?571101)

【研究意義】咖啡，學(xué)名Coffea，又名咖啡樹、阿拉伯咖啡等，為茜草科咖啡屬多年生經(jīng)濟作物?？Х仁鞘澜缟铣鸵酝獾淖畲蠼灰灼?，產(chǎn)量、產(chǎn)值及消費量均位居世界三大飲料作物(咖啡，茶葉，可可)之首，每年零售額達700億美元[1-4]，是全球經(jīng)濟的重要組成部分，全世界有70多個國家種植咖啡，主要分布于拉丁美洲、中西亞、中東南亞等[5]。我國咖啡種植區(qū)主要分布在云南和海南等熱帶地區(qū)。云南省以小?？Х葹橹鳎饕N植于南部和西南部的思茅、保山、德宏、西雙版納和文山等地區(qū)，海南以中?？Х葹橹鳎饕N植于萬寧、澄邁、文昌、?？诘鹊豙6]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引起的咖啡炭疽病是一種在咖啡樹上極易爆發(fā)流行的重要病害，在我國咖啡產(chǎn)區(qū)連年發(fā)生，病原菌可侵染嫩葉、葉柄、枝條和咖啡漿果等部位，引起葉片脫落、枝條干枯和果實腐爛，嚴(yán)重影響咖啡的產(chǎn)量和品質(zhì)[7-9]，已成為我國咖啡高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要生物限制因子之一。不同炭疽菌種的致病性可能存在一定差異，因此研究病原菌組成及其致病力的分化狀況可為咖啡炭疽病的防治提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M展】目前，國外學(xué)者對咖啡炭疽病的研究集中在咖啡漿果炭疽病(Colletotrichumkahawae)的病原學(xué)、抗病育種、寄主與病原互作方面[10-12]。但咖啡漿果炭疽菌在我國未見報道，并被列為我國入境植物檢疫性有害生物。國內(nèi)學(xué)者的研究多集中在海南種植區(qū)域咖啡炭疽病原菌鑒定、發(fā)病規(guī)律、生物學(xué)特性、藥劑篩選等方面[13-14]。【本研究切入點】前人對咖啡炭疽病病原菌鑒定的取樣點僅限于海南省內(nèi)的咖啡種植地，而我國云南省咖啡種植面積和產(chǎn)量占全國的90 %以上[15]，且不同省份咖啡的主栽品種和栽培條件都存在差異，咖啡炭疽病菌的種類和致病力是否存在差異不得而知，也未見相關(guān)報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對我國咖啡主要種植區(qū)疑似炭疽病的咖啡葉片、枝條和漿果進行組織分離，利用形態(tài)學(xué)結(jié)合ApMat基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)育進化分析方法對病原菌進行鑒定，旨在了解我國咖啡炭疽病病原菌種類及組成情況，采用人工接種方法對分離菌株進行致病力測定，明確不同菌種的致病力及優(yōu)勢種群，為咖啡抗病育種篩選和病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所熱帶特色經(jīng)濟作物病害研究室于2018-2019年在海南和云南省9個咖啡種植基地采集具有咖啡炭疽病典型癥狀的葉片和枝條，經(jīng)組織分離及純化獲得的74株菌株。用于致病力測定的咖啡品種為Catimor 7963，來源于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部云南瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)常規(guī)組織分離法及單孢分離純化獲得的菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d，定期觀察并記錄各菌株的形態(tài)特征，包括菌落大小、顏色、邊緣形狀、菌絲疏密以及菌絲生長和產(chǎn)孢速度。顯微觀察附著胞的大小、顏色和形態(tài)。 根據(jù)菌落和分生孢子形態(tài)特征對菌株進行初步的形態(tài)學(xué)鑒定[16]。

1.2.2 致病性測定 選取生長良好、大小相近的Catimor 7963嫩葉作為接種材料。接種前，用無菌水沖洗，1 % 次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用無菌水沖洗3～4 遍，陰涼處晾干葉片，整齊排放于接種盤里，然后將PDA上已培養(yǎng)5 d的待測菌株取直徑為6 mm的菌餅接種于葉片上，每個處理6次重復(fù)，并以無菌PDA培養(yǎng)基接種作為對照。接種后用保鮮膜進行密封保濕，并將接種盤置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。接種5 d后檢查病情，統(tǒng)計病斑擴展情況。

1.2.3 咖啡炭疽病病情分級標(biāo)準(zhǔn)及致病力分化測定 咖啡炭疽病病情分級參考黃根深和賴劍雄[17]的標(biāo)準(zhǔn)。0級：接種葉片無病斑；1級：接種葉片病斑面積之和<葉片總面積的1/8；2級：葉片總面積的1/8≤葉片病斑面積<葉片總面積1/4；3級：葉片總面積的1/4≤葉片病斑面積<葉片總面積1/2； 4級： 葉片病斑面積≥葉片總面積1/2。菌株致病性類型劃分標(biāo)準(zhǔn)參考李越等[18]標(biāo)準(zhǔn)：強致病類型：病情指數(shù)40～100.00；中致病類型：病情指數(shù)20～40；弱致病類型：病情指數(shù)0.10～20；無致病類型：病情指數(shù)為0。

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病數(shù)×發(fā)病級數(shù))/(調(diào)查數(shù)×4)×100

1.2.4 咖啡炭疽病菌ApMat基因序列分析 參照Silva等[19]的方法，采用真菌DNA提取試劑盒(Omega Fungal DNA Kit 50)提取病原菌總DNA并進行ApMat基因序列的PCR擴增和序列分析，擴增所用引物為如下。AMF：5′-TCATTCTACGTATGTGCCCG-3′;AMR：5′-CCAGAAATACACCGAACTTGC-3′。

PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 25 μl，10 μmol/L的左引物和右引物各2 μl，模板DNA 2 μl，最后加dd H2O補足至50 μl。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)35次，最后72 ℃延伸10 min。

擴增結(jié)束后，取8 μl擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(1 %，0.5×TAE電泳緩沖液)，將目標(biāo)條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物采用瓊脂凝膠回收試劑盒進行回收，并將PCR回收產(chǎn)物送至上海尚鉑生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序所獲得的每個菌株的ApMat基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對分析，下載與供試菌株基因序列相近菌種所對應(yīng)的基因序列作為參考菌株，運用Bioedit 和MEGA 4.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗所獲數(shù)據(jù)均采用SAS 9.0 軟件進行統(tǒng)計分析，多重比較采用 Duncan’s 新復(fù)極差檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡炭疽病菌的種類描述

55株炭疽菌在PDA上培養(yǎng)5～7 d后，觀察菌株的培養(yǎng)特征，經(jīng)形態(tài)鑒定，獲得24株Colletotrichumsiamense，其中8株(BSC2-1、BSC 2-2、BSC 4-1、BSC 7-1、BSC 7-2、BSC 9-1、BSC 9-3、BSC 10-2)來自海南白沙咖啡種植基地，3株(BD 15、BD 18、BD 23)來自云南芒市崩洞咖啡種植基地，2株(HG6、HG 9)來自云南后谷咖啡種植基地， 4株(BEC70A、BEC75A、BEC76B、BEC77D)來自云南南島河， 2株(BEC59A、BEC741B)來自云南熱帶作物學(xué)院示范基地，2株(BEC91B、BEC176B)來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部云南瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃，1株(RBEC193B)來自云南興華農(nóng)場，2株(F3-1、CF2)來自海南福山咖啡種植基地。獲得22株C.nupharicola，其中3株(BSC1-2、BSC 14-1、BSC 15-1)來自海南白沙咖啡種植基地，3株(HG7、HG 8、HG 10)來自云南后谷咖啡種植基地，9株(RL24、RL 25、RL 28、RL 29、RL 30、RL 31、RL 33、BEC80A 、BEC156A)來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部云南瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃，2株(BEC76A、BEC 77A)來自云南南島河，2株(BEC10A、BEC 14B)來自云南熱帶作物學(xué)院示范基地，3株(BEC106B、BEC 126B、BEC 127B)來自云南文山麻栗坡。獲得9株C.theobromicola，6株(BSC1-3、BSC 6-1、BSC 8-1、BSC 8-3、BSC 13-1、BSC 14-2)來自海南白沙咖啡種植基地，1株來自海南福山咖啡種植基地(IG3)、1株(RL32)來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部云南瑞麗咖啡種質(zhì)資源圃，1株(BEC108A)來自云南文山麻栗坡。C.siamense、C.nupharicola、C.theobromicola占比分別為：43.64 %、40 %和16.34 %。詳細結(jié)果如表1所示。

表1 供試咖啡炭疽病菌菌株信息

2.2 咖啡炭疽病病原菌的分子鑒定

對獲得的菌株進行ApMat基因PCR擴增，得到長度約為979 bp的基因片段，其電泳后條帶位置如圖1所示(僅展示了部分炭疽菌菌株的電泳結(jié)果)，引物的特異性較好，所得條帶均清晰明亮且單一無雜帶，將PCR 產(chǎn)物進行膠回收后送至上海尚鉑生物技術(shù)有限公司進行測序。

通過初步分析明確了74個供試菌株中的55株供試菌株屬于膠孢復(fù)合種群，其余19株供試菌株屬于膠孢復(fù)合種群之外的菌種，因此，利用對膠孢炭疽復(fù)合種群具有高效鑒定作用的ApMat基因?qū)?5個膠孢炭疽復(fù)合種群內(nèi)的供試菌株進行分析，通過軟件MEGA 6.0采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。55個供試菌株被分成3種，其中24個菌株在分支Colletotrichumsiamense上，支持率為71 %；9個菌株被分在C.theobromicola分支上，支持率為99 %；還有22個菌株位于C.nupharicola分支上，支持率為99 %。

2.3 咖啡炭疽病菌的致病力分化研究

根據(jù)致病力將55株菌株分為強致病性菌、中致病性菌和弱致病性菌。其中，強致病性菌38株，病情指數(shù)在42.01～75.56；中致病性菌6株，病情指數(shù)在28.56～38.68；弱致病性菌11株，病情指數(shù)在10.25～19.88。其中Colletotrichumtheobromicola的致病力最強，分離所獲得的9株菌株均具有強致病力；其次是C.siamense，在獲得的24株菌株中，有18株具有強致病力，達到75 %；在22株C.nupharicola菌株中，強致病力菌株有11株，其余菌株中有4株致病力中等，7株致病力較弱；55株炭疽菌株的致病性分化與地理來源有一定的關(guān)系，來自于海南白沙咖啡種植基地和云南農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源苗圃的大部分炭疽菌株致病力屬中致病性或強致病性。

3 討 論

本文采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ApMat基因序列比對分析法，將55個咖啡炭疽菌株鑒定分為3個炭疽菌種，分別為Colletotrichumsiamense(24株，43.64 %)、C.nupharicola(22株，40.00 %)、C.theobromicola(9株，16.36 %)。李楊[20]對海南省油茶炭疽病菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)C.camelliae、C.siamense、C.fructicola3個種；曹學(xué)仁等[14]對橡膠樹上的炭疽致病菌種進行研究，發(fā)現(xiàn)C.fructicola、C.siamense、C.cairnsense3個種，說明能侵染作物的炭疽菌種類型較豐富。本次試驗獲得的3個炭疽菌種中C.siamense的占比最高，為43.64 %，此前，C.siamense寄主范圍廣泛，全球分布，能引起多種植物炭疽病[21-24]，該菌是Than 等[25]首次從泰國辣椒上分離出的，但當(dāng)時被鑒定為C.gloeosporioides， Weir等[21]對這一結(jié)果進行了修正。

形態(tài)學(xué)特征在炭疽菌屬的分類鑒定中發(fā)揮了重要作用。吳文平等[26]認(rèn)為炭疽菌的形態(tài)特征在種間差異較大，而在種內(nèi)較穩(wěn)定，可作為炭疽菌屬分類鑒定的一項重要依據(jù)。Liu等[27]研究表明，除C.gloeosporioides，C.simense，C.fruticola3個近緣種外，依據(jù)分生孢子的形態(tài)和大小可以明顯區(qū)分C.truncatum，C.scovillei和C.brevisporum。但本試驗獲得的3個炭疽菌種的分生孢子和附著孢在形態(tài)、大小和顏色等形態(tài)特征上較為相似，并且同一種內(nèi)的形態(tài)也并不一致，所以無法根據(jù)特征準(zhǔn)確鑒定菌種。因此在炭疽菌屬的分類鑒定中單憑形態(tài)學(xué)特征無法將菌株進行準(zhǔn)確的鑒定，需要借助分子生物學(xué)等其它方法進行輔助鑒定。

表2 55株炭疽病菌菌株致病性測定結(jié)果

MAT(mating type locus)基因是真菌基因組中獨特的片段，能夠控制細胞配型識別和編輯有性循環(huán)，包含豐富的遺傳信息，可用于建立其親緣關(guān)系和物種的界限[28-29]。最近研究表明，ApMat標(biāo)記能夠有效對C.gloeosporioides復(fù)合種和Csiamense復(fù)合種進行種類鑒定[19,22,30-31]，Sharma等在芒果膠孢炭疽菌株鑒定研究中，相對多基因(ITS、ACT、CAL、Tub2、CHS-1和GAPDH)序列分析法，ApMat單基因序列分析法能更精確的區(qū)分大多數(shù)種，并且將遲羅炭疽菌確定為復(fù)合種[31]；進一步依據(jù)ApMat序列對來自印度的 73個暹羅炭疽復(fù)合種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定出6個已知種和1個新種。本次試驗中利用ApMat基因?qū)?fù)合種群進行分析，共鑒定出了3個炭疽菌種，分別為C.siamense、C.nupharicola、C.theobromicola。

炭疽菌具有很強的侵染性，可危害多種植物，但在不同寄主植物、地域、氣候等環(huán)境條件下，優(yōu)勢種群也會發(fā)生改變，并且不同菌種之間的致病性及致病力均有差異。在致病力測定試驗中，發(fā)現(xiàn)不同菌種之間致病力存在明顯差異。其中C.theobromicola的致病力最強，來自海南白沙咖啡種植基地和云南農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源苗圃的大部分菌株致病力屬中等以上。

4 結(jié) 論

本研究對分離自我國海南和云南的74株咖啡炭疽病菌進行鑒定，結(jié)果表明，55個菌株鑒定為膠孢復(fù)合種群，且歸為3個種：Colletotrichumsiamense、C.nupharicola、C.theobromicola。不同菌種之間的致病力存在差異，且與來源地相關(guān)。