不同VIGS體系在棉花中沉默效率的研究

吳 潔，劉 帥，馬晶晶，楊兆光，喬艷艷，趙 沛，吳珍平，操宇琳，張朝軍

(1.江西省棉花研究所/國家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鄱陽湖綜合試驗(yàn)站，江西 九江 332105;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000;3.塔里木大學(xué)，新疆 阿拉爾 843300)

【研究意義】病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的一種高通量、高效、快速的反向遺傳學(xué)技術(shù)。其原理是目標(biāo)基因接入病毒載體，形成重組病毒后侵染植株，目標(biāo)基因片段轉(zhuǎn)錄成dsRNA，隨后dsRNA被內(nèi)切酶Dicer類似物切割成21～24 nt的siRNA，siRNA在植株中與一些特定的蛋白質(zhì)相結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex，RISC)，RISC與同源RNA互作，目標(biāo)基因mRNA降解[1-3]。本文選用的2個(gè)VIGS體系棉花葉皺縮病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV)載體和煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)載體是棉花中常用的2種VIGS體系。通常2種載體都可以通過沉默葉綠素合成基因，從而得到植株的白化表型[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TRV載體是自2001年以來運(yùn)用最廣泛的VIGS載體，Gao等[6]在2011年將RNA病毒TRV介導(dǎo)的VIGS體系運(yùn)用于研究棉花的基因功能。Tuttle等[5]在2008年通過用粒子轟擊和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法建立了棉花中的DNA病毒CLCrV介導(dǎo)的VIGS體系。TRV體系在植株中的沉默持續(xù)時(shí)間短，而CLCrV體系表型可維持在棉花的整個(gè)生育期中[7-8],但對(duì)2個(gè)VIGS體系在棉花不同發(fā)育時(shí)期和不同部位沉默效率的研究較少。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycinphosphotransferaseⅡ,nptⅡ)是轉(zhuǎn)基因植物中常用的選擇性標(biāo)記基因，它通過合成新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)卡那霉素(Kan)產(chǎn)生抗性。利用VIGS技術(shù)沉默轉(zhuǎn)基因植株中的nptII基因會(huì)使得轉(zhuǎn)基因植株喪失Kan抗性[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的抗Kan的nptII基因?yàn)槟繕?biāo)基因，構(gòu)建2種VIGS體系介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默載體，通過農(nóng)桿菌注射法侵染棉花子葉，對(duì)2個(gè)VIGS體系侵染的棉花植株不同時(shí)期及不同部位進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】比較2套VIGS體系在棉花中的基因沉默效率和沉默時(shí)間的差異，為驗(yàn)證棉花基因功能選取合適的VIGS體系提供參考，對(duì)棉花基因功能的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的棉花材料為含有抗KannptⅡ基因的常規(guī)陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種中棉所41(CCRI 41)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所轉(zhuǎn)基因課題提供。

TRV空載體大腸桿菌pYL-156，TRV陽性對(duì)照農(nóng)桿菌，TRV輔助農(nóng)桿菌pYL-192，CLCrV陽性對(duì)照農(nóng)桿菌，CLCrV空載體大腸桿菌pCLCrVA，CLCrV輔助農(nóng)桿菌pCLCrVB等皆由轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。

多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(RNAprep Pure Plant kit)和質(zhì)粒小提試劑盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Taq酶及熒光定量試劑盒(SYBR?Premix ExTaq)購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，無縫克隆酶(ClonExpress?Ultra One Step Cloning Kit)購自南京諾維贊生物科技有限公司，凝膠回收試劑盒購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、乙酰丁香酮(AS)、2% -巰基乙醇、卡那霉素、利福平等其他生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1nptII基因的檢測(cè) 取播種1周后的CCRI 41棉花整株，CTAB法[10]提取基因組DNA作為模板，根據(jù)NCBI中公布的nptⅡ基因序列(GenBank: AUA17992.1)，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物：nptII-F:CTATGACTGGGCACAACAGACAAT，nptII-R:TCGTCAAGAAGGCGATAGAAGG，擴(kuò)增出的片段大小為 720 bp。

1.2.2 VIGS載體的構(gòu)建 以CCRI 41基因組DNA為模板，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)構(gòu)建2個(gè)VIGS體系所需引物：TRV-F-XbaI:AAGGTTACCGAATTCTCTAGACCGGATCAAGCGTATGCAG，TRV-R-BamH I: CGTGAGCTCGGTACCGGATCCAAG ATGG ATTGCACGCAGG，擴(kuò)增片段大小為 350 bp左右；CLCRV-F-SpeI:CAAAATGGCATGCCTGCAGACTAGTCCGGATCAAGCGTATGCAG，CLCRV-R-AscI:AGACCCCGTTATTGTTACCGGGCGCGCCAA GATGGATTGCACGCAGG，擴(kuò)增片段大小為 350 bp左右。使用南京諾維贊生物科技有限公司的無縫克隆酶將擴(kuò)增到的目的片段與其相應(yīng)的VIGS載體連接，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證獲得病毒重組干涉載體pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ。

1.2.3 農(nóng)桿菌的制備和侵染 將得到的重組質(zhì)粒pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中(具體步驟參照說明書)。挑取陽性克隆菌落PCR檢測(cè)正確后，將TRV體系中的陽性克隆菌落pYL-156-nptⅡ與pYL-156空載體農(nóng)桿菌，pYL-192輔助載體農(nóng)桿菌，TRV陽性對(duì)照農(nóng)桿菌菌液和CLCrV體系中的pCLCrVA-nptⅡ陽性克隆菌落，CLCrV空載體pCLCrVA農(nóng)桿菌，CLCrV輔助pCLCrVB農(nóng)桿菌，CLCrV陽性對(duì)照農(nóng)桿菌菌液，分別加入到含Kan、利福平(Rif)和硫酸慶大霉素(Gen)的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min，搖菌8～10 h。吸取 500 μl上述搖好的各菌液加入到Kan、Rif、Gen的LB三抗液體培養(yǎng)基中，并同時(shí)加入終濃度為10 mmol/L的MES和終濃度為20 μmol/L的AS，28 ℃，200 r/min搖菌過夜。取培養(yǎng)好的菌液于50 mL離心管中4000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，加入適量重懸液(無菌蒸餾水中MES 10 mmol/L，AS 200 mmol/L，MgCl210 mmol/L)充分懸浮菌體，使用 Nanodrop2000C在 600 nm 波長下調(diào)整各菌液OD600=1.5左右。分別將已懸好的pYL-192輔助載體農(nóng)桿菌和CLCrV輔助pCLCrVB農(nóng)桿菌懸液與其相應(yīng)VIGS體系目的基因、空載體、陽性對(duì)照農(nóng)桿菌懸液分別按照體積1∶1混勻，25 ℃靜置 3～6 h備用。

播種陸地棉CCRI 41種子，28 ℃，光照/黑暗=14/10h條件下培養(yǎng) 7 d后，取子葉平展、真葉還未冒出或剛冒出時(shí)的棉花幼苗，用注射器針頭輕劃一下子葉背面，用去掉針頭的1 mL注射器將菌液從背面注入棉花子葉，使菌液侵染整個(gè)子葉，注射面積達(dá)到98 %以上。注射后的棉花植株避光處理12 h，再次置于正常光照(28 ℃，光照/黑暗=14/10 h)下繼續(xù)培養(yǎng)[9]。

1.2.4 表型分析與PCR檢測(cè) 觀察2種體系TRV和CLCrV陽性對(duì)照棉花植株葉片白化時(shí)間和表型。當(dāng)陽性對(duì)照葉片出現(xiàn)白化表型，取空白對(duì)照和nptⅡ沉默植株的葉片，用CTAB法提取DNA。設(shè)計(jì)TRV載體檢測(cè)引物TRV-A-F1：GTGGACTTAGATTCTGTGAGTAAGG；TRV-A-R1：ACGGATCTACTTAAAGAA CCGTAGT，PCR擴(kuò)增片段大小為 256 bp。設(shè)計(jì)CLCrV載體檢測(cè)引物CLCrV-A-F1：GGGAGCTCCACTTGGGATAGGTTAAGAA；CLCrV-A-R1：CCATCGATGTCCCTTATTAACTTTAGGGC，PCR擴(kuò)增片段大小為275 bp。檢測(cè)2種病毒載體是否成功侵染棉花植株。

1.2.5 qRT-PCR分析 取注射過nptII基因和空載體15、30、45、60、75、90 d的棉花葉片，以及75和95 d的蕾、花、花藥組織部位提取RNA。所用試劑盒為多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，具體方法參照說明)。將提取出的RNA用熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(具體方法參照說明)，獲得2種體系的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以棉花中的actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，內(nèi)參引物AF：5'-TTTGGCATCATACCTTT-3'，AR：5'-CACTGGCATATAGGGA-3'。設(shè)計(jì)檢測(cè)nptⅡ基因表達(dá)的特異引物nptⅡ-Q-F: 5'-CACGAGGAAGCGGTCA-3' 和nptⅡ-Q-R：5'-CCTGCTTGCCGAATATC-3'，對(duì)不同組織樣品中nptⅡ基因表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，所用試劑為TaKaRa SYBR?Premix ExTaq(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，具體步驟參照說明)，所用儀器為Applied Biosystems 7500(Applied Biosystems，美國)。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)性重復(fù)，獲得數(shù)據(jù)采用2-△△ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，使用EXCEL軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中棉所41中nptⅡ基因的檢測(cè)

對(duì)陸地棉CCRI 41棉花植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)其基因組中是否含有nptⅡ基因，結(jié)果顯示該品種植株能夠擴(kuò)增出nptⅡ基因片段(圖1)，擴(kuò)增片段大小為720 bp左右，與預(yù)期片段大小一致，擴(kuò)增條帶單一，無非特異條帶，說明所選CCRI 41棉花植株基因組中含有nptⅡ基因片段。

2.2 2種病毒載體的構(gòu)建

pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ 2個(gè)載體分別進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后，對(duì)構(gòu)建好的TRV和CLCrV病毒沉默載體農(nóng)桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到350 bp左右的片段(圖2)，與預(yù)期片段大小一致，擴(kuò)增條帶單一，無非特異條帶，表明目的載體pYL-156-nptⅡ和pCLCrVA-nptⅡ構(gòu)建成功。

2.3 農(nóng)桿菌侵染后棉花葉片表型及PCR檢測(cè)

農(nóng)桿菌侵染12 d后，接種TRV陽性對(duì)照的植株葉片從頂端開始出現(xiàn)白化表型，空白對(duì)照植株頂端葉片顏色正常為嫩綠色(圖3-A)。侵染23 d后，接種CLCrV陽性對(duì)照的植株出現(xiàn)表型變化，頂端分生組織附近的幼嫩葉片開始出現(xiàn)白化表型，而空白對(duì)照葉片顏色正常未出現(xiàn)白化表型(圖3-B)。取2個(gè)體系沉默nptⅡ基因和空白對(duì)照棉花植株葉片，提取DNA，PCR擴(kuò)增檢測(cè)TRV病毒載體和CLCrV病毒載體是否進(jìn)入植株并起作用，擴(kuò)增分別得到256和275 bp大小的片段(圖4)，與預(yù)期片段一致，表明2個(gè)病毒載體已作用于棉花植株中。

2.4 2個(gè)病毒體系葉片中nptⅡ基因沉默效率比較

檢測(cè)TRV體系和CLCrV體系15、30、45、60、75、90 d棉花葉片中nptⅡ基因的沉默效率，比較2個(gè)體系在棉花不同發(fā)育時(shí)期對(duì)目的基因沉默效率的持續(xù)性差異。與空載體對(duì)照相比，農(nóng)桿菌接種15 d，TRV體系植株葉片表達(dá)量被高度抑制(圖5)，沉默效率達(dá)到 99.6 %，而CLCrV體系在農(nóng)桿菌接種后30 d，目的基因抑制效果達(dá)到最強(qiáng)，沉默效率達(dá)到 85 %，說明TRV體系比CLCrV體系對(duì)目的基因的沉默效率高且TRV體系的沉默效果更快。后期TRV體系對(duì)目的基因的沉默效率逐漸減弱，在注射農(nóng)桿菌后75及90 d，沉默效率分別46 %和22 %，說明TRV體系對(duì)目的基因的沉默效率會(huì)隨著棉花植株的生長逐漸減弱。CLCrV體系在60、75、90 d的沉默效率分別為84 %、82 %、77 %，說明CLCrV載體能夠在棉花中持久、高效的誘導(dǎo)內(nèi)源基因的沉默。

2.5 2個(gè)病毒體系棉花生殖器官中nptⅡ基因沉默效率比較

檢測(cè)2個(gè)體系75和90 d在蕾、花、花藥中nptⅡ基因的沉默效率，比較2個(gè)體系在棉花不同發(fā)育部位對(duì)目的基因沉默效率的差異。TRV體系中只有蕾中的nptⅡ基因表達(dá)量被較少的抑制(圖6)，75、90 d的沉默效率分別為12 %和11 %，而棉花其它生殖器官發(fā)育部位基本不能誘導(dǎo)目的基因的沉默。CLCrV體系75和90 d在蕾中對(duì)nptⅡ基因的沉默效率分別為63 %和61 %，花中的沉默效率分別為46 %和51 %，花藥中的沉默效率分別為38 %和33 %，說明與TRV載體相比，CLCrV載體能夠在棉花蕾、花、花藥等生殖器官發(fā)育部位誘導(dǎo)目的基因的沉默。

3 討 論

VIGS 技術(shù)具有操作迅速、簡單、成本低，使用較小的片段達(dá)到較高的沉默效果以及短期內(nèi)能夠觀察到基因沉默后表型變化等的特點(diǎn)，特別適用于像棉花這樣的生長周期長、遺傳轉(zhuǎn)化過程費(fèi)力耗時(shí)，基因組功能冗余的植物，因此被廣泛地應(yīng)用于棉花基因功能的研究[11-13]。王心宇等[14]通過在棉花中建立TRV病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系，抑制了棉花中GhMAPKKK基因的表達(dá)，使得抑制后的棉花植株接種黃萎病菌后更易感病，驗(yàn)證了GhMAPKKK基因參與棉花對(duì)黃萎病菌的抗性反應(yīng)的基因功能。VIGS病毒載體的選擇作為試驗(yàn)的重要步驟，決定著試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。在驗(yàn)證棉花中相關(guān)基因功能的研究中，前人選擇TRV病毒作為VIGS技術(shù)載體，驗(yàn)證TRV-VIGS體系在不同棉種中的侵染效果和侵染部位；使用CLCrV作為VIGS技術(shù)載體，研究該病毒載體在棉花VIGS技術(shù)中建立和適用性[15-17]。本研究基于2種病毒載體構(gòu)建了TRV-VIGS和CLCrV-VIGS2種體系，在同一棉花品種中驗(yàn)證2種體系目的基因在棉花葉片中的沉默效率、沉默時(shí)間的差異以及棉花生殖器官中的沉默效率差異。

本研究構(gòu)建了基于TRV病毒載體和CLCrV病毒載體的2種VIGS病毒沉默體系，成功侵染棉花后，TRV體系與CLCrV體系在不同發(fā)育時(shí)期葉片中相對(duì)表達(dá)量的比較，證明TRV病毒在棉花VIGS技術(shù)里是沉默效率較高的病毒載體，但持續(xù)時(shí)間較CLCrV體系短，且生長發(fā)育后期沉默效率逐漸降低。CLCrV體系基因沉默效率雖比TRV體系略低，但沉默效率較穩(wěn)定、持久，能夠作用于棉花植株生長發(fā)育的整個(gè)階段。比較TRV體系與CLCrV體系在不同生殖器官中的相對(duì)表達(dá)量，TRV體系在棉花生殖器官中的沉默效果不明顯，而CLCrV體系有較好的沉默效果，可作用于棉花蕾、花、花藥等部位，表明在研究棉花蕾、花、花藥等生殖器官中的基因功能時(shí)，可選用CLCrV介導(dǎo)的基因沉默表達(dá)載體。

4 結(jié) 論

TRV病毒沉默體系主要適用于接菌后短期內(nèi)棉花內(nèi)源基因的沉默，適用于抗逆基因的功能驗(yàn)證；CLCrV病毒沉默體系適用于棉花生長發(fā)育過程中起長期作用基因的沉默，可以研究生殖生長相關(guān)的基因的功能?，F(xiàn)階段已通過VIGS技術(shù)在棉花中成功鑒定出許多基因功能，為棉花的分子育種提供有價(jià)值的基因資源，本研究為驗(yàn)證棉花中不同時(shí)期不同部位基因功能選擇不同VIGS載體提供理論參考，對(duì)研究棉花基因功能乃至基因工程具有重要意義。