嗜水氣單胞菌外膜蛋白OmpK的原核表達(dá)、抗原性分析及抗血漿殺菌作用研究

榮 娜，康 超，孫 薇，簡(jiǎn)思杰，伍娜娜，劉 祥

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001)

【研究意義】嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為革蘭氏陰性短桿菌，是一種條件性病原菌[1]，主要感染淡水魚(yú)類(lèi)，引發(fā)局部出血和敗血癥[2-3]，給漁業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。此外，人類(lèi)的腦膜炎、胃腸炎和敗血癥等疾病也和此菌有關(guān)[4]。嗜水氣單胞菌疾病傳統(tǒng)上是用抗生素控制，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體藥物殘留和菌株耐藥性等問(wèn)題[5-6]。疫苗接種作為一種有效策略，已經(jīng)在大規(guī)模商業(yè)養(yǎng)殖中發(fā)揮了重要作用[7]，但目前還未研制出抗嗜水氣單胞菌感染的商用疫苗，大多研究主要集中于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段[8-9]。因此，開(kāi)發(fā)嗜水氣單胞菌新型漁用疫苗至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)是嗜水氣單胞菌的毒力因子之一[10]，位于細(xì)菌最外層，使得蛋白抗原表位暴露[11]，易被宿主識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)而激發(fā)免疫應(yīng)答，在嗜水氣單胞菌感染的防治中具有重要作用。Khushiramani等[12]用純化的外膜蛋白OmpTS免疫鯉魚(yú)并制備了滴度較高的抗體，證實(shí)該蛋白在鯉魚(yú)體內(nèi)具有高度的免疫原性。Maiti等[13]利用外膜蛋白OmpW在兔體內(nèi)制備了抗重組蛋白的多克隆抗體，并證實(shí)了抗體的特異性反應(yīng)。因此，嗜水氣單胞菌外膜蛋白有望成為疫苗開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)。【本研究切入點(diǎn)】本研究選取嗜水氣單胞菌主要外膜蛋白OmpK為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分子克隆獲得OmpK蛋白的原核表達(dá)菌株，探討其最佳表達(dá)條件；純化獲得OmpK蛋白并制備小鼠抗血清；探究OmpK蛋白抵抗魚(yú)血漿殺菌的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】此研究結(jié)果為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白功能研究與疫苗開(kāi)發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 嗜水氣單胞菌ATCC 7966、EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21菌株及pET-32a質(zhì)粒由陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所保存；昆明鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑Taq聚合酶、內(nèi)切酶BamH Ι和XhoΙ、T4-DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司；IPTG購(gòu)自西安沃爾森生物科技有限公司；TMB顯色液為西安赫特生物科技有限公司產(chǎn)品；山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于Sigma公司；引物合成、基因測(cè)序由天潤(rùn)奧科生物公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 查找并獲取不同菌株OmpK的蛋白序列，利用GeneDoc軟件和MEGA軟件分別進(jìn)行OmpK同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析；通過(guò)ProParam數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)OmpK的等電點(diǎn)、親水性和半衰期等理化性質(zhì)，并在ProScale analysis數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取親水性圖譜；采用TMHMM 2.0和SignalP 5.0軟件預(yù)測(cè)OmpK的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽區(qū)域，并通過(guò)SOPMA和SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)OmpK的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。最后使用STRING軟件在線(xiàn)構(gòu)建OmpK與其它蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的嗜水氣單胞菌ATCC7966全基因組，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ompK基因。序列如下：Sense Primer: AAAGGAT CCATGGCCAAATTTACCAAGAC; Anti-sense Primer: AGCCTCGAGTTAGAACTTGTAGGTAAC(劃線(xiàn)位置分別為酶切位點(diǎn)BamH Ι和XhoⅠ)。以全基因組作為模板，利用Taq聚合酶擴(kuò)增ompK基因，擴(kuò)增體系為50 μL，退火溫度、延伸時(shí)間分別設(shè)定為55 ℃、1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠鑒定后回收，使用BamH Ι 和XhoⅠ2種內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pET-32a與PCR產(chǎn)物，通過(guò)T4-DNA連接酶將ompK基因連接至質(zhì)粒pET-32a，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a中，獲得重組質(zhì)粒。雙酶切和基因測(cè)序進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，進(jìn)行OmpK蛋白外源表達(dá)。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)及純化 挑取表達(dá)菌單菌落培養(yǎng)12～16 h，以1∶100轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD600為0.6，加入0.1 mol/L的IPTG，搖床誘導(dǎo)6 h，收集1 mL菌液，菌體加入蛋白上樣緩沖液后于沸水中煮樣5 min，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)OmpK蛋白表達(dá)，結(jié)合包涵體洗滌和SDS-PAGE蛋白電泳切膠法純化OmpK蛋白。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?表1)探究OmpK蛋白最佳表達(dá)條件。主要步驟為：將過(guò)夜培養(yǎng)的OmpK表達(dá)菌液以1∶100比例接入600 mL培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至設(shè)定的OD600值，按照表中要求加入不同濃度的IPTG，每組進(jìn)行3次重復(fù)。取1 mL誘導(dǎo)菌液，菌體加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，樣品通過(guò)SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的OmpK蛋白表達(dá)圖譜。通過(guò)軟件Phoretix 1D和SPSS分別對(duì)表達(dá)圖譜光密度和不同因子作以顯著性分析。

1.2.5 蛋白小鼠抗血清的制備及特異性檢測(cè) 選用20 g左右昆明鼠，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只。取100 μg純化的OmpK蛋白與100 μL弗氏完全佐劑充分混合，腹腔注射免疫小鼠。14 d后，等量蛋白混合100 μL弗氏不完全佐劑，加強(qiáng)免疫小鼠。7 d后，進(jìn)行第3次免疫，對(duì)照組免疫PBS。

1周后眼球取血，血液于4 ℃待血清自然析出后，3000 r/min離心10 min，收集抗血清于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用Western blot檢測(cè)OmpK抗血清的特異性，簡(jiǎn)要過(guò)程如下：SDS-PAGE電泳嗜水氣單胞菌全蛋白，于80 V電壓下轉(zhuǎn)NC膜，NC膜在含5%脫脂牛奶的TNT緩沖液中充分封閉2 h后，與不同稀釋倍數(shù)(1∶400, 1∶800, 1∶1200, 1∶1600)的OmpK小鼠抗血清于室溫孵育90 min，對(duì)照為陰性抗血清。NC膜經(jīng)洗滌后與二抗(1∶3000倍稀釋)于室溫孵育90 min，在DAB顯色液中充分顯色以檢測(cè)OmpK抗血清的特異性。

1.2.6 體外模擬蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的相互作用 采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)OmpK抗血清與嗜水氣單胞菌的體外相互作用：培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至OD600約1.0，菌體用1%的甲醛生理鹽水80 ℃滅活90 min，生理鹽水調(diào)整菌液OD600為0.2，分裝為1 mL/管(菌量108cfu)。取100 μL不同稀釋倍數(shù)的OmpK抗血清(1∶400, 1∶800, 1∶1600, 1∶3200, 1∶6400)與小管菌體于室溫輕搖孵育90 min，對(duì)照為陰性血清。菌體再與200 μL的二抗(1∶3000倍稀釋)孵育1 h，用20 μL PBS重懸菌體并轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)板中，加入200 μL TMB顯色液，避光充分顯色10 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，450 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.7 蛋白抵抗血漿殺菌作用 培養(yǎng)嗜水氣單胞菌12～16 h，以1∶100比例接入100 mL新的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至OD600為0.5，菌體用0.85%生理鹽水洗滌并調(diào)整OD600為1.0，分裝為1 mL/管，小管菌體分別與600 μL不同稀釋倍數(shù)的魚(yú)血漿(未稀釋血漿、1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32)于28 ℃，200 r/min孵育5 h，對(duì)照為生理鹽水。洗滌菌體3次，SDS-PAGE分離全菌蛋白并轉(zhuǎn)NC膜，NC膜充分封閉后依次與一抗、二抗孵育，采用DAB顯色法進(jìn)行顯色，通過(guò)觀(guān)察特異性條帶的亮度分析OmpK蛋白的差異表達(dá)，評(píng)價(jià)其抵抗血漿殺菌的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 OmpK蛋白的同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析 利用GeneDoc軟件繪制氣單胞菌屬間不同菌株的OmpK蛋白氨基酸序列同源比對(duì)圖(圖1)，氣單胞菌屬間不同菌株OmpK蛋白同源性均較高。使用MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)不同種類(lèi)的氣單胞菌間進(jìn)化關(guān)系較近，其中嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和中間氣單胞菌3種菌株親緣關(guān)系更為緊密。因此，推測(cè)OmpK蛋白可能為不同種類(lèi)的氣單胞菌提供交叉免疫保護(hù)作用。

圖2 OmpK系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.1.2 OmpK理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè) ProtParam數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示：OmpK含有280個(gè)氨基酸，分子量大小為32061.57，等電點(diǎn)為5.08，半衰期大于10 h，不穩(wěn)定指數(shù)為27.40，屬于穩(wěn)定蛋白；親水性圖譜分析顯示氨基酸最大分值為0.011，最小為-2.010，親水性平均值為-0.430，表明OmpK為親水性蛋白(圖3-A)；由跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖譜(圖3-B)可知，7～30位氨基酸形成一個(gè)可信度較高的跨膜區(qū)域；信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3-C)顯示，該蛋白的信號(hào)肽組成序列為1～23位氨基酸，23～24位氨基酸之間存在切割位點(diǎn)，可信度達(dá)到0.9444；SOPMA軟件二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α-螺旋占全序列18.57%，延伸鏈占33.93%，無(wú)規(guī)則卷曲占47.50%(圖3-D)。SWISS-MODEL軟件三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OmpK蛋白的的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為桶狀(圖3-E)；通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)僅有g(shù)pt與AHA-1131 2種蛋白與OmpK存在直接作用(圖3-F)。

A：親水性預(yù)測(cè)；B：跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C：信號(hào)肽預(yù)測(cè)；D：二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；E：三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；F：蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.2 OmpK重組菌株的構(gòu)建

以全基因組為模板，利用上下游引物擴(kuò)增ompK基因，電泳檢測(cè)顯示約在843 bp處有目標(biāo)條帶存在(圖4-A)，大小與ompK基因相一致。重組質(zhì)粒pET-32a-ompK經(jīng)BamH Ι和XhoⅠ雙酶切，得到約843 bp的目標(biāo)條帶，符合理論大小(圖4-B)。目的基因經(jīng)測(cè)序比對(duì)，顯示與NCBI公布的ompK基因序列一致，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21獲得OmpK重組表達(dá)菌株。

A：PCR擴(kuò)增ompK基因；B：重組質(zhì)粒的雙酶切；M：DNA marker；1：ompK基因；2：重組質(zhì)粒pET-32a-ompK；3：Bam H Ι和Xho Ⅰ雙酶切

2.3 OmpK蛋白的表達(dá)純化

OmpK重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，電泳顯示目標(biāo)蛋白成功表達(dá)，分子量大小約51 kDa；利用包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳切膠法純化獲得OmpK蛋白(圖5)。

M：蛋白marker；1：未誘導(dǎo)菌株；2：誘導(dǎo)菌株；3：純化的OmpK蛋白

2.4 OmpK蛋白最佳表達(dá)條件的優(yōu)化

為確定OmpK蛋白的最佳表達(dá)條件，每個(gè)條件組合進(jìn)行3組重復(fù)。誘導(dǎo)菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳獲得不同誘導(dǎo)條件下的蛋白表達(dá)圖譜(圖6)，從表3可得出，OmpK菌株最佳表達(dá)條件組合為A3B3C3D2，即在菌液濃度達(dá)到OD600=1.0時(shí)，選擇終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，于28 ℃誘導(dǎo)8 h。由表4表明，在OmpK蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度達(dá)到顯著性，因此，適度的誘導(dǎo)劑濃度對(duì)于OmpK蛋白的高效表達(dá)尤為重要。

表2 OmpK蛋白表達(dá)圖譜光密度分析

表3 OmpK光密度數(shù)值的極差分析

表4 OmpK光密度數(shù)值的方差分析

A，B，C為3次重復(fù)；M：蛋白marker；1：未誘導(dǎo)菌株；2～4：OD600值為0.5，誘導(dǎo)溫度分別為28，32，37 ℃：5～7：OD600值為0.8，誘導(dǎo)溫度分別為28，32，37 ℃；8～10：OD600值為1.0，誘導(dǎo)溫度分別為28，32，37 ℃

2.5 OmpK蛋白抗血清的特異性與效價(jià)檢測(cè)

Western blot驗(yàn)證OmpK蛋白抗血清特異性，結(jié)果顯示在約31 KDa處出現(xiàn)特異性條帶，陰性對(duì)照無(wú)條帶，表明OmpK蛋白抗血清具有良好的特異性且抗血清效價(jià)達(dá)到1∶1600(圖7)。

M：蛋白marker；1～4：抗血清稀釋倍數(shù)分別為為1∶400，1∶800，1∶1200，1∶1600；5: 陰性血清(1∶400倍稀釋)

2.6 體外模擬OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌相互作用

由圖8顯示，隨著抗血清稀釋倍數(shù)的增大，OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌的結(jié)合能力逐漸減弱，當(dāng)抗體滴度達(dá)到1∶3200時(shí)，仍可檢測(cè)到兩者的相互作用。由此可見(jiàn)，OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌在體外存在相互作用，OmpK蛋白可能存在較好的抗原性。

圖8 OmpK蛋白抗血清與嗜水氣單胞菌體外相互作用

2.7 OmpK蛋白抵抗魚(yú)血漿的殺菌作用

采用Western blot檢測(cè)OmpK的差異表達(dá)情況(圖9)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OmpK蛋白均檢測(cè)到特異性條帶，且隨著血漿濃度的降低OmpK的表達(dá)呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)OmpK可能為孔道蛋白，通過(guò)關(guān)閉孔道，以有效抵抗血漿殺菌因子進(jìn)入細(xì)胞而殺傷菌體。

1～5：血漿稀釋倍為1∶2, 1∶4, 1∶8, 1∶16, 1∶32；6：未稀釋血漿；7：陽(yáng)性對(duì)照(生理鹽水)

3 討 論

嗜水氣單胞菌是一種廣泛存在的病原體，對(duì)人和動(dòng)物均有致病性[14]，主要可引發(fā)魚(yú)類(lèi)的氣單胞菌敗血癥，也可導(dǎo)致人類(lèi)胃腸炎和皮膚感染。在該菌的防治方面，以往的抗生素手段療效好，但極易引起機(jī)體耐藥性[6,15]。疫苗免疫作為一種安全且無(wú)毒害的防治手段[16]，備受青睞。目前處于研究熱點(diǎn)的漁用疫苗包括亞單位疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗等[17]。其中亞單位疫苗是以免疫活性的片段作為組分，免疫作用穩(wěn)定持久，是一種潛在的高效疫苗[18]，而嗜水氣單胞菌的外膜蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性[19]，可作為疫苗開(kāi)發(fā)的候選成分。本研究構(gòu)建了的嗜水氣單胞菌OmpK蛋白表達(dá)菌株，制備了OmpK蛋白多克隆抗體，為疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)親緣關(guān)系、理化性質(zhì)及高級(jí)結(jié)構(gòu)等[20]。本研究發(fā)現(xiàn)OmpK蛋白在氣單胞菌屬間同源性較高，表明OmpK蛋白在不同種類(lèi)的氣單胞菌間所參與的耐藥機(jī)制可能相近；OmpK免疫機(jī)體產(chǎn)生的抗體，可能同時(shí)抵御多種氣單胞菌的感染。二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主(47.50%)，因其易扭曲盤(pán)旋，暴露在蛋白外層，有利于優(yōu)勢(shì)細(xì)胞抗原表位的形成[21]，為研發(fā)廣譜性O(shè)mpK蛋白疫苗制劑提供理論依據(jù)。

多克隆抗體制備周期短且效果好，常應(yīng)用于蛋白的免疫功能研究[22]。本研究以純化的蛋白免疫小鼠制備了特異性較好的OmpK蛋白多克隆抗體，且抗體效價(jià)達(dá)到1∶1600倍，為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白的功能研究與疫苗開(kāi)發(fā)提供良好的生物學(xué)基礎(chǔ)材料。

蛋白的外源表達(dá)由于受到宿主的影響，其最佳表達(dá)條件往往是唯一的，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌液OD600為1.0，IPTG終濃度為0.5 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)8 h，OmpK蛋白獲得最大表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的IPTG和長(zhǎng)時(shí)間誘導(dǎo)會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，影響蛋白表達(dá)[23-24]，與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度IPTG(0.5 mmol/L)，8 h誘導(dǎo)一致；此外，低溫誘導(dǎo)利于活性蛋白的表達(dá)，可有效降低包涵體產(chǎn)生[25]，本研究也發(fā)現(xiàn)低溫(28 ℃)更有助于OmpK表達(dá)，為工業(yè)大量獲取OmpK蛋白提供參考依據(jù)。

體外模擬OmpK蛋白多克隆抗體與嗜水氣單胞菌的識(shí)別作用，結(jié)果顯示兩者在體外存在相互作用，表明獲得了特異性較好的OmpK蛋白多克隆抗體。細(xì)菌在機(jī)體內(nèi)被清除往往需要有相應(yīng)的抗體與其互相識(shí)別[26]，本研究在體外模擬蛋白抵抗魚(yú)血漿殺菌作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌進(jìn)入魚(yú)體后，OmpK呈現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)量，推測(cè)OmpK蛋白可能為孔道蛋白，通過(guò)關(guān)閉通道以抵抗血漿因子識(shí)別，從而保護(hù)細(xì)菌，這也與所預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)為桶狀相吻合。有研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌外膜蛋白TolC攜帶外排基因，屬于外排泵蛋白，表現(xiàn)為上升表達(dá)量以抵抗藥物作用[27]，這與本研究中OmpK蛋白呈現(xiàn)的下調(diào)機(jī)制恰好相反，本研究為揭示相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

OmpK在氣單胞菌屬間蛋白同源性較高，可能在多種氣單胞菌間具有免疫保護(hù)作用；并獲得其理化性質(zhì)和形態(tài)結(jié)構(gòu)。成功表達(dá)并純化OmpK蛋白，獲得其最佳表達(dá)條件，制備了特異性較好的OmpK多克隆抗體，效價(jià)達(dá)到1∶3200，OmpK抗血清對(duì)嗜水氣單胞菌具有較好的免疫識(shí)別作用，具有較好的抗原性；OmpK可通過(guò)下調(diào)表達(dá)實(shí)現(xiàn)抵抗魚(yú)血漿對(duì)嗜水氣單胞菌的殺菌作用，為嗜水氣單胞菌OmpK蛋白的生物學(xué)功能提供理論支持。