促生菌接種對(duì)青稞根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

姚有華，王玉林，姚曉華，白羿雄，安立昆，李 新，吳昆侖*

(1.省部共建青棵和秏牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850002；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧 810016；3.青海省青稞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；4.國(guó)家麥類改良中心青海青稞分中心，青海 西寧 810016)

【研究意義】微生物肥料可以在保證養(yǎng)分被充分利用的同時(shí)可兼顧環(huán)境不被污染，它具有增進(jìn)土壤肥力、制造和協(xié)助農(nóng)作物吸收營(yíng)養(yǎng)、增強(qiáng)植物抗病和抗旱能力、減少化肥使用量的作用[1]，青藏高原是我國(guó)重要的生態(tài)安全屏障，其中青海高原被譽(yù)為中華水塔，在全國(guó)具有重要的生態(tài)安全戰(zhàn)略地位，環(huán)境保護(hù)的重要性不言而喻，在青藏高原農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用微生物肥料是實(shí)施環(huán)境保護(hù)戰(zhàn)略的有效手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根際促生菌作為有益細(xì)菌，定殖在根際土壤中，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)進(jìn)而減少化肥施用[2-3]。根際促生菌通過其菌株具有的溶磷、分泌鐵載體、生物固氮、吲哚乙酸和解鉀等特征對(duì)植物產(chǎn)生促生作用[4]。大量研究表明，促生菌菌株的定殖可導(dǎo)致根際土壤有益菌群數(shù)量的增加[5]，并可以活化土壤微生物功能菌群的活性而增加菌群數(shù)，從而通過減輕或抑制病害發(fā)生和產(chǎn)生植物激素或者促生作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)[6]。近年來，通過接種促生菌來調(diào)節(jié)作物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和菌群多樣性，進(jìn)而達(dá)到促生作物生長(zhǎng)的目的成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)學(xué)者研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，認(rèn)為通過促生菌接種，可明顯改變植物根際細(xì)、真菌群落結(jié)構(gòu)和菌群多樣性，顯著增加有益微生物的豐度，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5-6]。目前，微生物菌肥研究備受關(guān)注，學(xué)者們已從不同作物中分離篩選出促生菌株，已應(yīng)用于工廠化菌肥生產(chǎn)并供農(nóng)業(yè)生產(chǎn)利用[7-11]。而本研究前期分離篩選到的芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)2株菌株未見是否具有促生效應(yīng)的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤微生物是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，而促生菌對(duì)青稞根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響的相關(guān)研究相對(duì)匱乏，因此本研究利用前期篩選出的2株促生芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)菌株進(jìn)行浸種處理，于青稞灌漿期采集根際土壤樣品，采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，探討促生菌浸種對(duì)青稞根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和菌群多樣性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】揭示促生菌接種對(duì)青稞灌漿期根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，探討促生菌接種對(duì)功能微生物菌群多樣性的影響，從根際土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的角度解析促生菌對(duì)青稞的促生效應(yīng)，為促生菌肥在青稞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 于2016年7月，在青海省香日德農(nóng)場(chǎng)(海拔2950 m，97°22′741″E、37°22′757″N)青稞高產(chǎn)創(chuàng)建試驗(yàn)田中采集健康青稞植株，帶回實(shí)驗(yàn)室并從中分離篩選出2株促生菌TSXJ4和GSXJA，分子鑒定分別為芽孢桿菌(Bacillussp.)與青霉菌(Penicilliumsp.)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2017年4月至8月，在青海省西寧市二十里鋪鎮(zhèn)農(nóng)林科學(xué)院種質(zhì)資源創(chuàng)新試驗(yàn)基地進(jìn)行。該地屬青海省東部湟水河流域灌區(qū)，36°62′N，101°77′E，海拔2309.00 m。土壤類型為栗鈣土，容重1.50 g/cm3，田間持水率15.20%，耕層有機(jī)質(zhì)含量22.49 g/kg，全氮含量1.78 g/kg，速效磷含量37.48 mg/kg。2017年青稞生育期內(nèi)(4-8月)降雨量為321.7 mm，平均氣溫分別為14.3 ℃，試驗(yàn)期內(nèi)無極端天氣出現(xiàn)(圖1)。

圖1 2017年青稞生育期月降雨量和月平均氣溫

1.3 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積60 m2(行長(zhǎng)3 m，行距20 cm，每小區(qū)10行)，3個(gè)接種處理各設(shè)3次重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，各小區(qū)間設(shè)置50 cm間距。于2017年4月上旬，取接種和未接種青稞種子，每小區(qū)每行人工開溝均勻點(diǎn)播40粒，覆土后輕度鎮(zhèn)壓，田間管理同試驗(yàn)區(qū)一般大田。于青稞灌漿期，取各處理1.5 g根際土壤，置于-20 ℃冰箱保藏，用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 促生菌液的制備 用接種環(huán)分別挑取促生菌TSXJ4、GSXJA菌苔，接種至已滅菌的PDA培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中18～24 h進(jìn)行菌株活化[12]。取TSXJ4菌株將其接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩48 h 后用無菌水調(diào)節(jié)其濃度至106個(gè)/mL[12]。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)旺盛且斜面培養(yǎng)的GSXJA，使用無菌水沖洗斜面上孢子將孢子濃度調(diào)節(jié)為106個(gè)/mL[13]。

1.4.2 接種處理 取 5% NaClO 對(duì)青稞種子進(jìn)行表面消毒并使用滅菌水淋洗 3 次。用濃度為106個(gè)/mL TSXJ4與GSXJA菌液浸種10 h(測(cè)試組)，用未接種PDA發(fā)酵液浸種10 h(CK)。

1.4.3 樣品的預(yù)處理 稱取樣品200 mg，置于2 mL已滅菌離心管，加入70%乙醇1 mL，室溫10 000 r/min離心3 min，后加入1×PBS溶液，室溫10 000 r/min離心3 min，以上離心完后均棄置上層液體[14]。

1.4.4 土壤微生物基因組DNA的提取 細(xì)菌與真菌總DNA提取均利用試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，OMEGA)。

1.4.5 土壤細(xì)菌16srDNA與真菌18srDNA 測(cè)序 對(duì)基因組DNA利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行精確定量，以確定PCR反應(yīng)DNA加入的量[14]。Miseq測(cè)序平臺(tái)V3～V4通用引物(341F/805R)已被16s rDNAPCR所用的引物融合[15]，真菌18s rDNA PCR采用 NS1-FUNG通用引物NS1和FUNGAL。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件參照戴瑞卿[14]、王秀紅[15]等的方法。由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行混合樣品后續(xù)的樣品建庫(kù)與測(cè)序。

1.4.6 稀疏性曲線 預(yù)處理后的序列中的非擴(kuò)增區(qū)域序列使用Usearch軟件去除，然后進(jìn)行對(duì)序列的測(cè)序錯(cuò)誤矯正，調(diào)用uchime軟件進(jìn)行鑒定嵌合體序列，用Mothur 軟件以97%為劃定閾值做rarefaction分析，利用R制作稀釋曲線[16]。

1.4.7 OTU分布韋恩圖 樣本中共有和獨(dú)有的OTU的數(shù)目，利用VennDiagram package軟件統(tǒng)計(jì)，得出韋恩圖可直觀展現(xiàn)樣品的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況[17]。

1.4.8 基于OTU豐度的樣本聚類圖 利用VennDiagram package軟件，層次聚類(Hierarchical cluatering)分析根據(jù)beta多樣性距離矩陣進(jìn)行[15]，樣本聚類樹圖使用非加權(quán)組平均法UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)算法構(gòu)建[17]。

1.4.9 多樣性指數(shù)分析 利用mothur 軟件計(jì)算樣品包括Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)的α多樣性值[18]，Chao1指數(shù)值的高、低表示群落物種的豐富度高、低[18]；Shannon指數(shù)值的高、低表示群落多樣性的高、低。

Chao1 豐富度指數(shù)：

其中，Schao1為估計(jì)OTU數(shù)，Sobs表示實(shí)際觀測(cè)OTU數(shù)，n1和n2分別表示只含有1條序列和2條序列的OTU數(shù)目。

Shannon 多樣性指數(shù)：

其中，Sobs為實(shí)際觀測(cè)OTU數(shù)，ni表示第i個(gè)OTU包含序列數(shù)，N表示序列總數(shù)。

1.4.10 群落結(jié)構(gòu)組分圖 將OTU序列利用blastn軟件與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選出OTU序列最佳比對(duì)結(jié)果并進(jìn)行過濾，滿足相似度>90%、coverage>90%的序列進(jìn)行后續(xù)分類，將不滿足條件的序列歸為unclassified[19]。各分類層級(jí)水平上樣品的群落組成，參照分類學(xué)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，群落結(jié)構(gòu)組分圖可利用R軟件對(duì)物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行作圖得到[14]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物 DNA 的提取及純度檢測(cè)

采集各處理根際土壤樣本，微生物總 DNA使用試劑盒方法提取后經(jīng) 1%凝膠電泳檢測(cè)，由圖2可見，DNA提取條帶15kb以上，高亮度且無拖尾；由表1可知，3個(gè)樣品的DNA含量和純度較好，OD260/OD280值介于1.8～2.0之間，不存在RNA或者雜質(zhì)污染。

表1 DNA 濃度與純度

圖2 土壤DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 土壤微生物PCR 擴(kuò)增

圖3～4 是對(duì)土壤總 DNA 中的細(xì)菌(V3～V4區(qū)段)和真菌(NS1-FUNGPCR)擴(kuò)增后的結(jié)果，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后通過與基準(zhǔn)條帶對(duì)比發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌擴(kuò)增條帶在500 bp左右，真菌擴(kuò)增條帶均在600 bp以上，表明可以進(jìn)行高通量測(cè)序。

圖3 PCR 擴(kuò)增的細(xì)菌 V3～V4片段圖

圖4 PCR 擴(kuò)增的真菌NS1-FUNG片段

2.3 稀疏性曲線

從 圖5～6可知，參試樣品稀釋曲線均表現(xiàn)出平坦，這就說明所取的樣品準(zhǔn)確、合理，細(xì)、真菌群落結(jié)構(gòu)具有較高的置信度，能夠較真實(shí)反映細(xì)、真菌群落。

圖5 根際土壤真菌的Shannon 指數(shù)稀釋曲線

圖6 根際土壤細(xì)菌的Shannon 指數(shù)稀釋曲線

2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)

通過對(duì)細(xì)菌TSXJ4 V3～V4區(qū)段測(cè)序發(fā)現(xiàn)，參試樣本的原始序列條數(shù)為132020，有效序列總數(shù)為128173；通過對(duì)真菌GSXJ4 NS1-FUNGPCRNS1-FUNGPCR區(qū)段測(cè)序發(fā)現(xiàn)，參試樣本原始序列條數(shù)為 158 279，有效序列總數(shù)為158 185。通過對(duì)原始序列去冗余處理和聚類，得出在不同 OTU(Operational Taxonomic Units，操作分類單元)中參試樣品的豐度信息，3個(gè)樣品V3～V4區(qū)段共產(chǎn)生19 474個(gè) OTU，NS1-FUNGPCR區(qū)段共產(chǎn)生3346個(gè) OUT，每個(gè)樣品的有效序列數(shù)量和 OTU 數(shù)量。從表2可以看出，V3～V4區(qū)段 QC后的序列長(zhǎng)度都集中在400～421 bp；NS1-FUNGPCR區(qū)段QC后的序列長(zhǎng)度都集中310 bp之間左右，QC后的序列長(zhǎng)度可以進(jìn)行微生物鑒定。

表2 各樣本數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)

2.5 聚類分析

從圖7～8可知，樹枝的長(zhǎng)度代表樣本間的距離，越相似的樣本會(huì)越靠近，圖中CK組與樣品組樹枝長(zhǎng)度明顯不同，表明CK組與樣品組OUT豐度存在明顯差異。從圖9～10可以看出，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中GSXJ4與CK組特異OTU數(shù)為65.8%，TSXJ4與CK組特異OTU數(shù)為64.1%，真菌群落結(jié)構(gòu)中GSXJ4與CK組特異OTU數(shù)為74.3%，TSXJ4與CK組特異OTU數(shù)為74.0%，表明兩株菌都不同程度的改變了根際土壤中的細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)，且真菌群落結(jié)構(gòu)的變化更為明顯。

圖7 根際土壤細(xì)菌的樣本聚類圖

圖8 根際土壤真菌的樣本聚類圖

圖9 根際土壤細(xì)菌 OTUs 韋恩圖圖

2.6 根際土壤微生物多樣性

由表3 可以看出，根際土壤的細(xì)菌豐富度和多樣性均表現(xiàn)為GSXJ4>TSXJ4>CK，真菌豐富度和多樣性結(jié)果相反。這說明經(jīng)促生菌浸種的青稞根際土壤中的細(xì)菌多樣性顯著增加，物種豐富度較高；而真菌多樣性則顯著降低，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。

表3 土壤樣品多樣性指數(shù)分析

2.7 群落結(jié)構(gòu)分析

在綱的分類水平上，青稞根際土壤細(xì)菌分為 50個(gè)類群，在CK組Alphaproteobacteria(占15.17%)、Gammaproteobacteria(占10.49%)、Sphingobacteriia(占9.51%)、Betaproteobacteria(占8.06%)為優(yōu)勢(shì)菌群，其他菌類比例相對(duì)較低。在GSXJ4中，Alphaproteobacteria(占15.21%)、Gammaproteobacteria(占9.01%)、Actinobacteria、(占8.45%)、Betaproteobacteria(占7.6%)為優(yōu)勢(shì)菌群，在TSXJ4中，Alphaproteobacteria(占15.04%)，Gammaproteobacteria(占10.96%)，Actinobacteria(占9.09%)，Betaproteobacteria(占7.37%)為優(yōu)勢(shì)菌群，其他菌類比例相對(duì)較低(圖11)。青稞根際土壤真菌分為30個(gè)類群，在CK組Schizosaccharomycetes(占29.1%)、Sordariomycetes(占20.33%)、Agaricomycetes(占12.04%)為優(yōu)勢(shì)菌群，其他菌類比例相對(duì)較低。在GSXJ4中Schizosaccharomycetes(占33.9%)，Sordariomycetes(占14.31%)，Pezizomycetes(占17.77%)為優(yōu)勢(shì)菌群，在TSXJ4中Schizosaccharomycetes(占26.48%)，Sordariomycetes(占17.48%)，Pezizomycetes(占11.52%)為優(yōu)勢(shì)菌群，其他菌類比例相對(duì)較低(圖12)。表明，經(jīng)過GSXJ4與TSXJ4兩種菌浸種的青稞根際土壤菌群發(fā)生了明顯改變，在細(xì)菌群落中影響較大的為Actinobacteria及Sphingobacteriia，通過浸種處理，Actinobacteria數(shù)量明顯上升，由CK組的5.66%上升為8.45%及9.09%，數(shù)量增加了49.3%及60.6%，而Sphingobacteriia數(shù)量明顯下降，由CK組9.51%下降為4.71%及5.03%，數(shù)量減少50.5%及47.1%。在真菌群落中影響較大的為Agaricomycetes及Pezizomycetes，經(jīng)浸種處理，Agaricomycetes數(shù)量明顯下降，由CK組12.04%下降為4.12%及9.21%，數(shù)量減少65.8%及23.5%，而Pezizomycetes，數(shù)量明顯上升，由CK組3.48%上升為17.77%及11.52%，數(shù)量增加410.63%及231.03%以上。從上述結(jié)果可以看出，促生菌對(duì)青稞根際微生物的影響中，放線菌綱微生物反應(yīng)較為敏感，真菌各菌群數(shù)目發(fā)生較大波動(dòng)。而放線菌綱微生物是土壤中的主要類群，也是抑制土壤病害，促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)的有益菌群。

圖10 根際土壤真菌 OTUs韋恩

從屬的分類水平上看，經(jīng)促生菌浸種處理后，細(xì)菌種群多樣性增加，但優(yōu)勢(shì)菌群種類及數(shù)量較穩(wěn)定，真菌種類變化較細(xì)菌明顯，從圖13～14可以看出，Lecythophora與Rhizoctonia數(shù)量明顯下降，而Plicaria數(shù)量明顯上升。Rhizoctonia是引起水稻紋枯病的主要致病菌，所以促生菌浸種處理可以抑制植株病原菌，提高植物的抗病性。

圖13 根際土壤細(xì)菌genus水平群落結(jié)構(gòu)組分圖

3 討 論

根際土壤是植物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)吸收最直接的場(chǎng)所，根際微生物總數(shù)量的多少與土壤肥力存在正相關(guān)關(guān)系，所以微生物種類的多樣性是維持土壤健康及監(jiān)測(cè)土壤質(zhì)量變化的重要指標(biāo)[20]。所以研究不同促生菌浸種栽培下，植物根際微生物數(shù)量的變化規(guī)律，對(duì)于探索植物對(duì)土壤的作用過程和促生機(jī)理具有重要作用。

王西洋[21]研究顯示，外施微生物菌劑對(duì)微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)都有顯著影響。土壤微生物Chao1 指數(shù)和 Shannon 指數(shù)是表征群落多樣性的常用指數(shù)，可以揭示土壤微生物種類和功能的差異[21-22]。Shannon 指數(shù)是群落生物多樣性的度量指標(biāo)，一般來講，指數(shù)越高，微生物種類越豐富，營(yíng)養(yǎng)結(jié)夠復(fù)雜，穩(wěn)定性相對(duì)較高。在本實(shí)驗(yàn)中，促生菌浸種栽培下，青稞植株根際細(xì)菌豐富度和多樣性明顯高于對(duì)照，這在一定程度上反映出促生菌浸種使得青稞根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性提高。

圖14 根際土壤真菌genus水平群落結(jié)構(gòu)組分圖

土壤微生物以細(xì)菌為最多，種類豐富，所以生物量也高；土壤中放線菌的數(shù)量也很大，僅次于細(xì)菌，但生物量并不低于細(xì)菌，是主要的抗生素分泌菌，在抑制有害病原微生物生長(zhǎng)方面有重要作用；真菌在數(shù)量上要比細(xì)菌和放線菌要少，在不同的環(huán)境中數(shù)量變化比較大[22]，真菌可分解土壤中眾多微生物所不能分解的物質(zhì)，具有很強(qiáng)的分解能力，對(duì)提高耕地肥力和改善土壤物理結(jié)構(gòu)作用顯著。細(xì)菌/真菌是表征土壤肥力的一個(gè)潛在指標(biāo)[23]，本研究中，促生菌浸種的青稞植株，根際土壤細(xì)菌多樣性提高，而真菌多樣性降低，表明根際土壤肥力提升，其可能原因是促生菌影響了根系化感物質(zhì)的分泌，這些化學(xué)物質(zhì)在根際土壤中不斷積累，原有的微生態(tài)環(huán)境改變，導(dǎo)致各類微生物的相對(duì)數(shù)量和比例發(fā)生變化，最終導(dǎo)致多樣性指數(shù)的變化。在這些變化中，細(xì)菌種群的多樣性明顯增加，但優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)穩(wěn)定，真菌數(shù)量及種類的變化較細(xì)菌明顯，Lecythophora、Rhizoctonia、Plicaria都發(fā)生了變化，由此可以推論，促生菌在植物定殖后，可以改善土壤環(huán)境微生態(tài)，增加土壤肥力。而且本研究結(jié)果表明，促生菌對(duì)青稞根際微生物的影響中，放線菌綱微生物反應(yīng)較為敏感，而放線菌綱微生物是土壤中的主要類群，也是抑制土壤病害，促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)的有益菌群。

4 結(jié) 論

促生菌浸種栽培改變了根際土壤中的細(xì)菌及真菌群落結(jié)構(gòu)，且真菌群落結(jié)構(gòu)的變化更為明顯；促生菌浸種提高了青稞根際土壤中細(xì)菌的豐富度和多樣性，而降低了真菌的豐富度和多樣性；青稞根際土壤放線菌綱微生物反應(yīng)對(duì)促生菌浸種較為敏感，且真菌各菌群數(shù)目變化波動(dòng)較大；促生菌浸種使青稞根際土壤細(xì)菌種群多樣性增加，但優(yōu)勢(shì)菌群種類及數(shù)量較穩(wěn)定，且真菌種類變化較細(xì)菌明顯。