基于原代細(xì)胞培養(yǎng)的三維腫瘤藥篩模型的初步研究

王健，張薈蓉，趙盼，王光鎖，鄒暢

1.深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518000；

2.暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518000；

3.南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 深圳 518052；

4.深圳市人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 深圳 518000；

5.深圳市腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療與分子診斷公共服務(wù)平臺(tái)，廣東 深圳 518000

研究表明，腫瘤的發(fā)生及發(fā)展與腫瘤所處的微環(huán)境有著直接必然的聯(lián)系[1]，體外腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)技術(shù)，能夠更好地模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)[2-3]。腫瘤細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立涉及到細(xì)胞生物學(xué)和組織工程學(xué)的交叉結(jié)合，相對(duì)于傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)，三維培養(yǎng)可為腫瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)搭建一個(gè)橋梁[4]。在腫瘤研究的基礎(chǔ)領(lǐng)域，三維培養(yǎng)體系的建立對(duì)于臨床前體外藥物的篩選、腫瘤干細(xì)胞的維持和分化以及信號(hào)的異常傳導(dǎo)都有著非常重要的研究意義[5-6]。特別是針對(duì)一些少見的惡性腫瘤，臨床前的藥敏實(shí)驗(yàn)和藥物篩選、三維培養(yǎng)體系的建立將會(huì)為不必要的Ⅰ、Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)提供有價(jià)值的引導(dǎo)，有效減少資金和資源的浪費(fèi)[7]。因此本實(shí)驗(yàn)在平面培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，嘗試建立一個(gè)穩(wěn)定有效的體外三維篩藥模型，并且通過試用不同化療藥物對(duì)該模型進(jìn)行了初步試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 腫瘤組織標(biāo)本來源于2020年1月至2020年7月在深圳市人民醫(yī)院胸外科接受手術(shù)切除的腫瘤患者。

1.1.2 主要試劑和藥物 完全培養(yǎng)基F培養(yǎng)基成分包括DMEM、F-12 nutrient mix、FBS、L-glutamine、hydrocortisone epidermal growth factor(EGF)、insulin、ROCK inhibitor(Y-27632)、青霉素/鏈霉素；胰酶包括0.05%的Trypsin/EDTA、0.25%的Trypsin/EDTA；主要化療藥物有順鉑、卡鉑、培美曲塞和鹽酸吉西他濱；其他還有海藻酸鈉溶液、氯化鈣。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng) 將胸外科手術(shù)取下的肺癌組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移至組織保護(hù)液中，并放置在冰上取回至實(shí)驗(yàn)室。腫瘤組織塊轉(zhuǎn)移至6 cm的培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次，洗去組織塊上的血水，用已經(jīng)高壓滅菌消毒的手術(shù)剪刀將組織剪成1 mm3小的組織碎塊，消化酶重懸轉(zhuǎn)移至15 mL的離心管，固定于37℃培養(yǎng)箱中消化0.5～3 h。在500×g、4℃離心5 min，棄去上清。沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，100μm的濾膜過濾后300×g、4℃離心5 min。細(xì)胞沉淀用F培養(yǎng)基重懸后鋪板在含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 原代細(xì)胞免疫熒光鑒定 將105的細(xì)胞接種在含有細(xì)胞爬片的24孔板中，第二天細(xì)胞貼壁后用PBS沖洗兩次，洗去培養(yǎng)基和漂浮的死細(xì)胞后用4%的多聚甲醛室溫固定30 min。PBS沖洗兩次后加入0.5%的Triton-X-100，室溫使其通透15 min，再用PBS沖洗兩次；用5%的BSA室溫封閉30 min，一抗分別為CK7、NapsinA、TTF-1和Ki67，按照1∶200的稀釋比加入，4°C過夜孵育。PBS沖洗3次，每次3～5 min，二抗1∶500稀釋，室溫孵育1 h后PBS洗3次，充分洗去抗體殘留。復(fù)染細(xì)胞核DAPI，以1∶1 000稀釋后常溫孵育10 min以后PBS漂洗3次，每次5 min。滴加抗淬滅劑，封片，熒光顯微鏡鏡檢。

1.2.3 原代肺癌細(xì)胞的三維培養(yǎng)及藥物敏感性測試模型構(gòu)建 將分離得到的原代肺癌細(xì)胞與海藻酸鈉溶液均勻混合(每毫升海藻酸鈉溶液中加入106個(gè)細(xì)胞)；利用銳孔擠壓法(將混合液吸入1 mL的無菌注射器中)控制力度均勻滴入100 mmol/L的CaCl2溶液中，鈣化30 min使之形成粒徑均一的凝膠微球；生理鹽水清洗兩次，培養(yǎng)基再清洗一次，將包埋癌細(xì)胞的海藻酸鈣凝膠微球轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，使之形成三維細(xì)胞團(tuán)；轉(zhuǎn)移相同個(gè)數(shù)的細(xì)胞團(tuán)至96孔板中，分別加藥處理48 h和72 h。

1.2.4 CCK8法檢測細(xì)胞毒性 每孔加入10%的CCK8新鮮培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織收集及病理鑒定 收取的組織標(biāo)本石蠟切片病理判定結(jié)果為浸潤性肺腺癌，腺泡型(約50%)+實(shí)體型(約40%)+乳頭型(約10%)，免疫組化結(jié)果顯示CK(+)，NapsinA(+)，TTF-1(+)。

2.2 原代肺癌細(xì)胞平面生長情況 分離得到的腫瘤細(xì)胞與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)3～7 d換液，在顯微鏡下可觀察到明顯的細(xì)胞克隆，腫瘤細(xì)胞貼壁聚集，緊密排列，成鵝卵石鋪路石狀，見圖1A；在共培養(yǎng)體系中，清晰可見島狀細(xì)胞團(tuán)，并被飼養(yǎng)層細(xì)胞緊密包裹生長，飼養(yǎng)層細(xì)胞呈梭形狀，與上皮細(xì)胞可明顯區(qū)分，見圖1B。

圖1 原代肺癌細(xì)胞生長形態(tài)

2.3 免疫熒光鑒定 培養(yǎng)的細(xì)胞用免疫熒光法進(jìn)行鑒定，如圖2所示，免疫熒光結(jié)果顯示CK7為強(qiáng)陽性，NapsinA和TTF-1均為陽性表達(dá)，Ki67細(xì)胞增殖為強(qiáng)陽性。免疫熒光抗體表達(dá)結(jié)果與患者腫瘤組織的病理結(jié)果一致，提示培養(yǎng)的原代細(xì)胞為肺腺癌腫瘤細(xì)胞。

圖2 原代肺癌細(xì)胞免疫熒光鑒定

2.4 原代肺癌細(xì)胞在三維培養(yǎng)體系中的培養(yǎng) 海藻酸鈉溶液與細(xì)胞混合，滴進(jìn)氯化鈣溶液中會(huì)形成海藻酸鈣凝膠微球，微球講細(xì)胞包裹形成一個(gè)三維體系，可以讓細(xì)胞在立體三維空間中持續(xù)生長，圖3A為一個(gè)海藻酸鈣凝膠微球，該微球大小均一，形態(tài)完整；圖3B是單個(gè)凝膠微球中細(xì)胞的生長狀態(tài)，單個(gè)細(xì)胞在微球中會(huì)形成小的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞團(tuán)懸浮生長，形成了一個(gè)封閉的三維環(huán)境。

2.5 原代肺癌細(xì)胞在三維培養(yǎng)體系中的藥物敏感性檢測 肺腺癌的臨床化療藥物主要包括順鉑、卡鉑、培美曲塞和鹽酸吉西他濱等，通過CCK8法檢測肺腺癌原代細(xì)胞在該三維體系中的抑制率，如圖4所示，藥物作用時(shí)間為48 h時(shí)，藥物抑制率為卡鉑＞吉西他濱＞順鉑＞培美曲塞；藥物作用時(shí)間為72 h時(shí)，順鉑＞卡鉑＞吉西他濱＞培美曲塞。此株原代細(xì)胞對(duì)培美曲塞的敏感性相對(duì)較低，對(duì)順鉑、卡鉑及吉西他濱的敏感性相差不大，在臨床上可選擇聯(lián)合用藥以提高對(duì)病情的控制程度。

圖3 原代細(xì)胞肺癌細(xì)胞的三維培養(yǎng)

圖4 不同化療藥物對(duì)肺癌原代細(xì)胞的抑制率

3 討論

肺癌是我國在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[8]。臨床醫(yī)生對(duì)于肺癌的化療用藥多限于經(jīng)驗(yàn)給藥，這種用藥模式會(huì)造成患者出現(xiàn)多重耐藥、不良反應(yīng)、效果欠佳等后果。有研究表明，有藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)的臨床治療效果要明顯優(yōu)于無藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的治療[9]。因此建立一種更接近體內(nèi)的成熟的體外藥篩模型，是非常重要的。在體外細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，研究者主要是在堅(jiān)硬的塑料或玻璃表面進(jìn)行2D培養(yǎng)，主要是因?yàn)?D培養(yǎng)簡單、方便和有高效的細(xì)胞增殖速度[10]。2D培養(yǎng)的細(xì)胞模型會(huì)與細(xì)胞真實(shí)的生存環(huán)境和生長方式有很大的不同，與3D培養(yǎng)相比，可以發(fā)現(xiàn)有明顯的生物學(xué)變化，包括免疫系統(tǒng)激活、防御反應(yīng)、細(xì)胞黏附和組織發(fā)育[11-13]。因此，3D系統(tǒng)特別是3D細(xì)胞培養(yǎng)體系在生物學(xué)上具有非常重要的意義，比如更經(jīng)濟(jì)高效的新藥開發(fā)、癌癥患者體外藥敏實(shí)驗(yàn)及發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞分化機(jī)制的基礎(chǔ)研究[10]。

目前三維培養(yǎng)主要有：三維成球培養(yǎng)(靜止性懸浮成球培養(yǎng)[14]、滴滴懸掛培養(yǎng)[15]、機(jī)械運(yùn)動(dòng)式培養(yǎng)[16])凝膠包埋培養(yǎng)(膠原[17]、藻酸鹽[18]、Matrigel[19])、三維組織工程支架培養(yǎng)[4，20]。水凝膠是親水聚合物交聯(lián)在一起的一種三維網(wǎng)絡(luò)，可以吸收大量的生物液體和水而膨脹，同時(shí)可以保持自己的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，就像一個(gè)活體組織一樣具有高水容量、滲透力和一致性[21]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，水凝膠在藥物輸送載體、創(chuàng)面材料和3D打印中的巨大應(yīng)用潛力和價(jià)值已得到證實(shí)[21]。

本實(shí)驗(yàn)研究首先用與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的2D培養(yǎng)體系在體外迅速獲得大量的原代肺癌細(xì)胞，然后利用海藻酸鈉水凝膠在3D培養(yǎng)體系方面的應(yīng)用，將得到的原代肺癌細(xì)胞與海藻酸鈉混合培養(yǎng)形成穩(wěn)定的海藻酸鈣凝膠微球，初步構(gòu)建了一個(gè)基于原代培養(yǎng)的3D腫瘤藥篩模型，并用此模型進(jìn)行了化療藥物篩選的初步試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該3D模型形成的細(xì)胞微球大小均一，形態(tài)完整，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；與其他的3D模型相比，該模型在藥物篩選時(shí)可以通過準(zhǔn)確地控制細(xì)胞球數(shù)量來統(tǒng)一細(xì)胞量進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，四種化療藥物處理結(jié)果提示，該細(xì)胞對(duì)順鉑、卡鉑及吉西他濱的敏感性比培美曲塞的敏感性高。綜上所述，該三維模型的建立，方法簡單，易于操作，成功率高，可為臨床上體外藥物篩選提供一定的基礎(chǔ)。