高分泌型K326近等基因系的創(chuàng)制和鑒定

任書樂，王召軍，閆筱筱，張洪映，李雪君，孫計(jì)平，崔紅*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002；

2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000

煙草腺毛豐富，其分泌物的主要成分為二萜化合物和蔗糖酯[1]，二者都是煙草重要的香氣前體物質(zhì)[2-3]。在不同類型煙草中，香料煙腺毛分泌物含量為最高，其次是雪茄煙，烤煙普遍較低[4]。二萜化合物包括西柏烷化合物和賴百當(dāng)化合物兩大類，西柏烷二萜在不同類型煙草中廣泛存在，賴百當(dāng)二萜則主要存在于香料煙和雪茄煙中[5]。煙草蔗糖酯根據(jù)分子量及酯化位置的不同可以分為六種類型（I-VI），但I(xiàn)II-VI型蔗糖酯只在香料煙和雪茄煙中存在，烤煙一般只含有I-II型蔗糖酯[4,6]。可見，腺毛分泌物與煙葉香氣品質(zhì)和風(fēng)味密切相關(guān)。

腺毛分泌物含量由腺毛密度、腺毛類型、分泌能力所共同決定。目前，本氏煙細(xì)胞周期蛋白基因NbCycB2對(duì)腺毛密度的調(diào)控機(jī)制已取得突破性進(jìn)展[7]，煙草NtCycB2基因?qū)煵菹倜l(fā)生的負(fù)向調(diào)控作用也已得到證明，K326中NtCycB2基因敲除可以顯著提高分泌型腺毛的密度和分泌物的含量[8-9]。但是，關(guān)于煙草腺毛類型、腺毛分泌能力的分子機(jī)制尚不明確，還無(wú)法進(jìn)行精確的分子定向改良。T.I.1068是美國(guó)農(nóng)業(yè)部收集的一份野生煙草種質(zhì)。其腺毛類型為分泌型，腺毛密度高，分泌能力強(qiáng)，分泌物成分齊全，包括西柏烷二萜、賴百當(dāng)二萜及I-VI型蔗糖酯，分泌物可達(dá)煙葉干重的16%[10]，是高分泌型煙草品種選育及腺毛發(fā)育及物質(zhì)代謝相關(guān)基因克隆的理想材料。

K326是廣泛栽培的烤煙品種，但因育成年代較早，其煙葉品質(zhì)也需要進(jìn)一步改良，以適宜煙草行業(yè)發(fā)展及消費(fèi)者的需求。在不同烤煙品種腺毛分泌物的比較研究中，K326腺毛分泌物含量高于紅大、翠碧1號(hào)和中煙100[11]，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于香料煙和雪茄煙品種[12]。由此推測(cè)，進(jìn)一步提高腺毛分泌物的含量，有可能是K326品質(zhì)改良的新的突破口。為此，本研究以K326為輪回親本、以高分泌型種質(zhì)資源T.I.1068為供體親本進(jìn)行多代回交，擬通過(guò)腺毛形態(tài)、葉面分泌物成分及農(nóng)藝性狀的綜合定向篩選，獲得高分泌型K326近等系，為K326葉面分泌物定向調(diào)控和品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為煙草品種K326和高分泌煙草種質(zhì)T.I.1068。種子由本實(shí)驗(yàn)室和河南省農(nóng)科院煙草研究所提供，品種雜交與回交試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)置在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)田（河南省許昌市），按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙栽培規(guī)程進(jìn)行田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的選育過(guò)程

以K326為輪回親本，以高分泌型種質(zhì)資源T.I.1068為供體親本，進(jìn)行雜交和連續(xù)回交，對(duì)回交后代進(jìn)行植株表型及腺毛形態(tài)的篩選，BC5F1與K326的農(nóng)藝性狀已趨于一致。BC5F1自交后，選取長(zhǎng)柄分泌型腺毛腺頭增大，羅丹明染色加深的BC5F1單株，進(jìn)行腺毛分泌物成分的檢測(cè)分析，從中獲得了高分泌型K326近等系HSK326（圖1）。

圖1 HSK326選育過(guò)程Fig.1 HSK326 selection process

1.2.2 腺毛形態(tài)的觀察

于煙株旺長(zhǎng)期取頂部10 cm葉片進(jìn)行腺毛染色與形態(tài)觀察。試驗(yàn)操作參考李艷華等[11]使用的方法，將葉片置于0.2%（W/V）的羅丹明B水溶液中浸染60 min，染色結(jié)束后依次放到4個(gè)裝有清水的燒杯中，每次5 s，涮去未結(jié)合的染料，用濾紙吸去多余水分，并置于室溫下，自然晾干。用剪刀在葉片中部沿主脈兩側(cè)1 cm處剪取6 mm×8 mm組織塊，置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下進(jìn)行長(zhǎng)柄分泌型腺毛腺頭大小以及羅丹明染色的觀察和長(zhǎng)柄分泌型、短柄分泌型以及非分泌型腺毛的密度統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 葉面分泌物檢測(cè)

于煙株盛花期取下部5～10葉位葉片進(jìn)行分泌物的提取和檢測(cè)，樣品制備以及前處理參考韓錦峰[13]的方法。每株材料取5片葉，每片葉取直徑為7 cm的葉圓片4片，每株材料共20片葉圓片。將葉圓片在二氯甲烷溶液中浸提，每個(gè)葉圓片浸提8次，每次2 s。在浸提液中加入1 mL內(nèi)標(biāo)（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液），混合均勻后進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，硅烷化處理后，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀TRACEGCULTRA—DSQ IIMS（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行檢測(cè)，色譜參數(shù)檢測(cè)參考王霄龍等[14]的方法。采用內(nèi)標(biāo)定量法（相對(duì)校正因子為1）進(jìn)行定量分析。

1.2.4 qRT-PCR 分析

在五葉一心期，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的K326、T.I.1068及HSK326各一株，取自下往上第三葉位且發(fā)育正常的葉片，采用Trizol法進(jìn)行RNA的提取。利用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以煙草核糖體蛋白基因L25為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)腺毛中西柏烷二萜和賴百當(dāng)二萜合成基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，每個(gè)材料進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，所用引物見表1。qPCR采用LightCycler? 480 SYBR Green Ⅰ Master試劑盒，具體反體系如下：SYBR Green Mix 10.0 μL，上、下游引物（10.0 μmo/L）各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，RNase free H2O 8.0 μL。在LightCycler? 480 Ⅱ型 熒 光 定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40次循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后，添加溶解曲線程序：95℃，15 s，60℃，15 s，20 min內(nèi)逐步升溫至95℃，最后95℃，15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 擴(kuò)增引物序列Tab. 1 Amplification of primer sequences

1.2.5NtCPS2基因測(cè)序分析

在八葉一心期取K326、T.I.1068及HSK326發(fā)育正常的葉片，采用CTAB法進(jìn)行DNA的提取。根據(jù)NtCPS2基因第4外顯子中G/T SNP的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物（F：TGGTGTTTTGATTGGCGAGTG；R：GGGGGCATAAAGGTGTCA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃10 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，35次循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，利用BioEdit 7.0 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.6 SSR分子標(biāo)記鑒定

在八葉一心期取K326、T.I.1068及HSK326發(fā)育正常的葉片，采用TIANGEN Plant Genomic DNA Kit試劑盒（離心柱型）進(jìn)行DNA提取。利用BMVSE基因緊密連鎖的分子標(biāo)記PT30354（F：TCGGTTTCTGCTCCAATTTC；R：TGTTCTACTGCTGG GTCGAA）和PT20315（F：ACACGACTTTTCATCTCCC；R：CGCATGAAATT GTAAGGG-30）對(duì)所提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18]。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠單泳道，選用寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司DL系列500 bp DNA Markers 作為參照，在1×TBE電泳緩沖液中電泳分離。電泳結(jié)束后，參照任民等[15]改良的NaOH銀染方法快速顯影。試驗(yàn)所用電泳儀器為DYY-12C 型（北京市六一儀器廠），儀器運(yùn)行參數(shù)為恒電壓1200 V，電流200 mA，功率60 W，電泳2 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分泌型K326的選育和形態(tài)比較分析

圖2 株型及腺毛形態(tài)比較Fig.2 Comparison of botany properties and trichome morphology

K326與T.I.1068的植株表型明顯不同。K326株型為筒形或塔形，葉形為長(zhǎng)橢圓形，葉數(shù)24～26片，莖葉夾角較大（圖2-1）；T.I.1068株型為塔形，葉形為披針形，葉數(shù)28～30片，莖葉夾角較?。▓D2-2）。二者葉面腺毛形態(tài)也具有明顯差異。K326腺毛類型為混合型，以長(zhǎng)柄分泌型為主，也有部分短柄分泌型和少量的非分泌型；長(zhǎng)柄腺毛腺頭較小，經(jīng)羅丹明染色后呈現(xiàn)淺粉色（圖2-4）。T.I.1068腺毛為分泌型，包括長(zhǎng)柄分泌型和短柄分泌型，缺少非分泌型；長(zhǎng)柄腺毛具有明顯的分泌囊，經(jīng)羅丹明染色后呈現(xiàn)玫紅色（圖2-5）。篩選獲得的高分泌型K326近等系HSK326的株型為塔形，葉形為長(zhǎng)橢圓形，葉數(shù)24片，莖葉夾角較大（圖2-3）；HSK326腺毛類型仍為混合型，但非分泌型腺毛比K326比例明顯減少，長(zhǎng)柄分泌型腺毛腺頭明顯增大，羅丹明著色加深（圖2-6）。從腺毛密度統(tǒng)計(jì)來(lái)看，HSK326腺毛總量介于K326與T.I.1068之間。與K326相比，HSK326腺毛密度提高了0.3倍。其中，長(zhǎng)柄分泌型腺毛密度提高了0.38倍，而非分泌型腺毛密度有所降低（圖3）。

圖3 腺毛密度比較Fig.3 Comparison analysis of trichome density

2.2 高分泌型K326葉面分泌物比較分析

在盛花期分別取K326、T.I.1068及HSK326的下部葉片，進(jìn)行葉面分泌物的萃取和GC/MS分析，結(jié)果如圖4所示。從組分上來(lái)看，HSK326與K326葉面分泌物組成成分一致，與T.I.1068具有較大差異。T.I.1068腺毛分泌物由西柏烷類二萜、賴百當(dāng)類二萜、烷烴類和I-V型蔗糖酯構(gòu)成；K326和HSK326的腺毛分泌物則只含有西柏烷類二萜、烷烴類以及I-II型糖酯，缺少賴百當(dāng)類二萜和III-V型糖酯。從含量上看，T.I.1068葉面分泌物總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于K326，HSK326介于二者之間。HSK326的分泌物總量是K326的1.88倍，其中，西柏烷類二萜提高了0.91倍，蔗糖酯含量提高了1.27倍，烷烴含量并無(wú)顯著變化。

2.3 高分泌型K326二萜及蔗糖酯合成基因分析

2.3.1 二萜合成基因表達(dá)水平及序列分析

采用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)K326、T.I.1068以及HSK326中賴百當(dāng)類二萜合成基因NtABS、NtCPS2以及西柏烷類二萜合成基因NtCBT、NtCYP71D的表達(dá)水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，T.I.1068中二萜合成基因的表達(dá)水平普遍高于K326；HSK326中西柏烷二萜合成關(guān)鍵基因NtCBT顯著高于K326，這與其西柏烷類化合物的大量積累相一致。賴百當(dāng)二萜合成關(guān)鍵基因NtCPS2雖在T.I.1068中表達(dá)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但在HSK326和K326中也有一定的表達(dá)量，但二者中并沒有檢測(cè)到賴百當(dāng)二萜的積累。

圖4 葉面分泌物檢測(cè)分析Fig.4 Chemical Analysis of leaf surface chemicals

圖5 二萜合成基因表達(dá)水平分析Fig.5 Analysis of the expression level of diterpene synthesis genes

根據(jù)Sallaud等人的研究結(jié)果[16]，NtCPS2基因第4外顯子中存在一個(gè)G/T的SNP，引起翻譯提前終止，是造成大部分烤煙中賴百當(dāng)二萜合成缺陷的主要原因。我們據(jù)此設(shè)計(jì)引物，分別對(duì)HSK326、K326及T.I.1068中NtCPS2基因目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯觯cT.I.1068相比，HSK326和K326在1542 bp處都發(fā)生了T堿基突變，這可能是二者賴百當(dāng)二萜缺失的主要原因。

圖6 HSK326、K326及T.I.1068 NtCPS2基因及蛋白序列比對(duì)分析Fig.6 NtCPS2 gene and protein sequence alignment analysis of HSK326, K326 and T.I.1068

2.3.2 III-VI型蔗糖酯合成連鎖分子標(biāo)記分析

BMVSE基因與煙草III-VI型蔗糖酯的生物合成密切相關(guān)[17]，但至今該基因的序列和功能還不清楚。Vontimitta等[6]對(duì)BMVSE基因進(jìn)行了遺傳定位，并開發(fā)了一系列與BMVSE連鎖的SSR分子標(biāo)記。其中PT20315和PT30354兩個(gè)標(biāo)記多態(tài)性穩(wěn)定，且與糖酯類型高度一致[18]。因此，我們選用這兩個(gè)標(biāo)記對(duì)HSK326、K326及T.I.1068進(jìn)行了基因型鑒定，結(jié)果如圖7所示。可以看出，PT20315和PT30354兩個(gè)標(biāo)記可以把親本K326和T.I.1068區(qū)分開來(lái)，而HSK326的帶型均與K326相同，說(shuō)明HSK326與K326中缺少III-VI型蔗糖酯合成的關(guān)鍵基因。這與蔗糖酯的檢測(cè)結(jié)果相一致。

圖7 HSK326、K326及T.I.1068中III-VI型糖酯合成基因分子標(biāo)記鑒定Fig.7 Molecular marker identification of type III-VI sugar ester synthesis genes in HSK326, K326 and T.I.1068

3 討論

煙草腺毛作為表皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，不僅是煙株與環(huán)境間的物理屏障，其分泌物更是天然的化學(xué)防線，與煙株抗性和煙葉品質(zhì)密切相關(guān)[19]。葉面分泌物含量的高低作為品種的遺傳特性，由腺毛密度、腺毛類型、腺毛分泌物合成及分泌能力等因素所共同決定?？緹熛倜珵榛旌闲?，分泌型與非分泌型共存。腺毛密度，尤其是長(zhǎng)柄分泌型腺毛的密度普遍較低，分泌能力不高，腺頭分泌囊較小，導(dǎo)致了其葉面腺毛分泌物含量在不同類型煙草中處于較低水平[12]。由于煙草腺毛發(fā)育及物質(zhì)代謝的分子調(diào)控機(jī)制并不十分清楚，采用常規(guī)選育技術(shù)，將種質(zhì)資源中的高分泌特性導(dǎo)入栽培品種，仍是目前行之有效的途徑之一。T.I.1068作為典型的高分泌型煙草資源，具有腺毛密度高、分泌旺盛、成分齊全等特點(diǎn)，是煙草葉面分泌物研究的典型材料[10]。本研究將T.I.1068作為供體親本與K326進(jìn)行雜交，經(jīng)過(guò)多代回交后，將其高分泌特性成功導(dǎo)入K326，獲得了高分泌型K326改良品系HSK326。

HSK326的一個(gè)明顯特征是腺毛密度較高。雖然，HSK326與K326的腺毛類型一致，但分泌型腺毛，包括長(zhǎng)柄分泌型和短柄分泌型的密度，比K326都有明顯增加。T.I.1068高腺毛密度的分子機(jī)制并不清楚。已有的研究證明，NtCycB2基因的突變會(huì)提高長(zhǎng)柄分泌型腺毛的密度[8]，但T.I.1068中該基因的序列和表達(dá)水平與K326相比，并無(wú)明顯差異（未發(fā)表）。從T.I.1068中非分泌型腺毛缺失，推測(cè)其控制非分泌型腺毛發(fā)生的基因通路受阻，這或許在某種程度上促進(jìn)了分泌型腺毛的發(fā)生。HSK326在分泌型腺毛密度提高的同時(shí)，非分泌型腺密度有所降低，預(yù)示煙草分泌型腺毛與非分泌型腺毛發(fā)生之間存在某種交叉調(diào)控機(jī)制。

腺毛分泌能力強(qiáng)是HSK326的另一個(gè)特征。形態(tài)觀察可以看出，HSK326腺頭分泌囊比K326明顯增大，羅丹明著色程度明顯加深，說(shuō)明其腺毛分泌物，尤其是糖酯的合成和分泌更為旺盛。GC/MS檢測(cè)結(jié)果也表明，HSK326腺毛分泌物總量雖然低于T.I.1068，但比K326提高了接近一倍，這與二萜合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平普遍提高相一致。腺毛密度的增加可能是導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高、分泌物含量增加的一個(gè)原因。然而HSK326的腺毛密度與K326相比僅提高了38%，但西柏烷二萜含量比K326提高了91%，蔗糖酯含量提高了127%，此外HSK326還表現(xiàn)出腺毛分泌囊增大、著色加深的表型，說(shuō)明單個(gè)腺毛中物質(zhì)合成和分泌能力的增強(qiáng)也促進(jìn)了腺毛分泌物總量的提高。

采用常規(guī)育種手段對(duì)腺毛分泌物含量進(jìn)行遺傳改良的一個(gè)難點(diǎn)是表型鑒定。前人研究表明煙草腺毛分泌物被腺頭細(xì)胞分泌出來(lái)后會(huì)儲(chǔ)存在腺頭部分，形成一個(gè)分泌囊[20]，因此分泌囊的大小反應(yīng)了腺毛分泌能力及腺毛分泌物的含量，利用羅丹明B對(duì)腺毛染色能夠較為準(zhǔn)確的對(duì)分泌物中的蔗糖酯進(jìn)行定量[21]，染色越深，糖酯含量越高。在HSK326選育過(guò)程中我們采用了比較腺毛分泌囊的大小結(jié)合化學(xué)染色的方法，有效解決了表型鑒定困難的問(wèn)題。利用這兩種觀察方法在苗期就可以完成表型觀察及候選單株的確定，從而省去了大群體的田間種植及分泌物提取檢測(cè)的過(guò)程，有效提高了煙草腺毛分泌能力品種選育的效率，對(duì)于煙草高香氣育種工作具有重要的參考意義。

從分泌物組成成分來(lái)看，HSK326與K326的二萜組成一致，都只含有西柏烷化合物，缺少冷杉醇、賴百當(dāng)二醇等賴百當(dāng)化合物。雖然，賴百當(dāng)二萜合成途徑關(guān)鍵基因NtCPS2在HSK326與K326中都能正常表達(dá)，但序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)T.I.1068和K326在NtCPS2基因1542 bp處存在一個(gè)G/T的SNP，K326中的T堿基能引起翻譯提前終止，造成腺毛分泌物中不含有賴百當(dāng)二萜。HSK326中對(duì)應(yīng)位置與K326相同，也為T堿基，使HSK326獲得了K326中賴百當(dāng)化合物缺失的特性。賴百當(dāng)類物質(zhì)會(huì)影響烤煙的香氣風(fēng)格，例如含有冷杉醇的“豫煙11”[11]、“大白筋”[22]都具有明顯的晾曬煙風(fēng)味。因此賴百當(dāng)類物質(zhì)的缺失對(duì)HSK326保持烤煙的香氣風(fēng)格至關(guān)重要。另外，HSK326與K326都只含有I-II型蔗糖酯，缺少III-VI型蔗糖酯。據(jù)Vontimitta等人報(bào)道[6]，III-VI型蔗糖酯合成基因BMVSE與冷杉醇合成基因NtCPS2呈現(xiàn)緊密連鎖狀態(tài)。因而，III-VI型蔗糖酯與冷杉醇常常共存于香料煙、雪茄等晾曬煙中，而在烤煙、白肋煙中則不含這兩類物質(zhì)。蔗糖酯對(duì)卷煙具有增香保潤(rùn)、增加甜感、改善吃味的作用[23]，至于III-VI型蔗糖酯對(duì)烤煙風(fēng)格的影響還未見有報(bào)道。我們?cè)贐C5F2群體的篩選中，也發(fā)現(xiàn)了打破BMVSE與NtCPS2連鎖的材料，不含冷杉醇但含有III-VI型蔗糖酯。對(duì)該材料的進(jìn)一步分析，有望闡明蔗糖酯不同組分對(duì)烤煙風(fēng)格的影響。

4 結(jié)論

本研究將K326與T.I.1068進(jìn)行雜交，以K326為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交，最終篩選獲得高分泌型K326近等系HSK326。HSK326在保持與K326植物學(xué)性狀基本一致的同時(shí)，葉面腺毛密度增加、分泌能力增強(qiáng)、分泌物含量顯著提高；而且，腺毛分泌物組分與K326高度一致，保持典型的烤煙葉面化學(xué)特征，具有較大的應(yīng)用潛力。