新輔助化療對(duì)大腸腺癌組織中的CXCL6、CXCL16表達(dá)的影響及其臨床意義

王麗華 李成

大腸癌為消化系統(tǒng)最常見癌癥之一,為全世界第三大常見惡性腫瘤,隨著環(huán)境污染加重,人們的飲食習(xí)慣改變,生活節(jié)奏的加快等等因素的影響,大腸癌發(fā)病率不斷地提高［1］。目前傳統(tǒng)的手術(shù)方式已經(jīng)不能滿足患者的需求,尤其對(duì)于中晚期大腸腺的患者來說,新輔助化療無疑給患者帶來希望和福音［2］。因此新輔助化療的療效檢測(cè)就顯得尤其重要。炎癥性趨化因子CXCL6 和CXCL16 可能會(huì)很好的反映出化療效果。據(jù)報(bào)道CXCL6/CXCL16 參與炎癥細(xì)胞的趨化,激發(fā)淋巴細(xì)胞、NK/T 細(xì)胞等,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［3］。新輔助化療后的癌組織及癌周組織微環(huán)境的改變提示新輔助化療的療效可能與CXCL6/CXCL16 有關(guān),也預(yù)示著CXCL6/CXCL16 可能成為癌癥的免疫治療的新的靶向位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集本院2014～2015 年患者術(shù)前經(jīng)過輔助化療、術(shù)后有完整病理的病例98 例,均為大腸腺癌中分化,Duke 分期均在Ⅲ期,患者平均年齡65.5 歲,男女比例為1.2∶1。收集2018～2019 年本院經(jīng)過新輔助化療大腸腺癌新鮮標(biāo)本30 例,5 例未經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌新鮮組織作為對(duì)照組?；颊咂骄挲g63.7 歲,男女比例為1.1∶1。所有經(jīng)過新輔助化療的患者均接受術(shù)前化療(替加氟注射液1 g,q.d.；亞葉酸鈣注射液0.2 g,q.d.；注射用鹽酸昂丹司瓊8 mg,q.d.),新輔助化療治療2～3 周后行大腸癌根治切除術(shù)。

1.2 抗體及試劑 兔抗CXCL6多克隆抗體(PA5-67571,美國(guó)賽默飛公司),工作濃度1∶100。兔抗CXCL16 多克隆抗體(ab101404,Abcam 公司),工作濃度1∶200。辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗以及二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購于上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 用4%甲醛分別固定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織,常規(guī)脫水后進(jìn)行石蠟包埋,切片,脫蠟,檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行抗原修復(fù),分別加入稀釋后的CXCL6 一抗、CXCL16 一抗,以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照,4℃過夜孵育,加入稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗,DAB 溶液顯色鏡下觀察陽性反應(yīng)。染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：癌細(xì)胞及癌周淋巴細(xì)胞免疫組化的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)用H-score 系統(tǒng)［4］：H-score=［1×(%cell 1+)+2×(%cell 2+)+3×(%cell 3+)］。陽性細(xì)胞百分比分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：得分在0～49 分為0 級(jí),得分在50～99 分為1 級(jí),等分在100～199 分為2 級(jí),得分在200～300 分為3 級(jí)。其中1+為細(xì)胞漿內(nèi)黃色著色；2+為細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色著色；3+為細(xì)胞漿內(nèi)棕褐色,粗顆粒狀著色。陽性著色細(xì)胞數(shù)：400 倍視野下每張玻片隨機(jī)選取5 個(gè)視野,計(jì)數(shù)至少200 個(gè)細(xì)胞,觀察每個(gè)視野中陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%,并取均值。

1.3.2 Western blot 分別取約1 g 新輔助化療大腸腺癌新鮮標(biāo)本及對(duì)照組織加入蛋白裂解液裂解后,以10 μg/10 μl 上樣量在到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳；采用濕式電轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上,轉(zhuǎn)膜條件為4℃,恒壓90 V,120 min；隨后在5%脫脂奶粉或者牛血清白蛋白(BSA)溶液中室溫封閉1 h；加入相應(yīng)的一抗在4℃下孵育過夜,TBST 將膜浸洗3 次,加入二抗室溫震蕩孵育1 h；TBST 浸洗3 次,5 min/次。浸洗后將膜放于發(fā)光板上,添加ECL 發(fā)光,利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)結(jié)合相關(guān)軟件檢測(cè)蛋白變化并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 患者隨訪 術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行隨訪,隨訪時(shí)間從手術(shù)后至2020年6月30日,術(shù)后2年每3個(gè)月隨訪1次,術(shù)后3～5 年每6 個(gè)月隨訪1 次,獲得患者生存情況,失訪患者納入死亡病例。

1.4 觀察指標(biāo) 分析CXCL16、CXCL6 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況以及大腸癌組織中CXCL6、CXCL16 升高水平與化療反應(yīng)效果的關(guān)系。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn) 新輔助化療后,癌組織面積可減少,該反應(yīng)可用腫瘤退縮分級(jí)來表示,新輔助化療后病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無存活癌細(xì)胞,腫瘤退縮分級(jí)為0 級(jí)(完全反應(yīng))；單個(gè)或小簇癌細(xì)胞殘留為1 級(jí)(中度反應(yīng))；殘留癌灶版間質(zhì)纖維化為2 級(jí)(輕度反應(yīng))；少數(shù)或無腫瘤細(xì)胞消退,大量癌細(xì)胞殘留為3 級(jí)(反應(yīng)不良)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn),多組組間比較使用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后 隨訪98 例患者,失訪3 例,隨訪率96.94%(95/98),95 例隨訪患者中死亡38 例,剩余57 例患者健康或帶瘤生存,5 年總生存率為60.00%(57/95)。隨著腫瘤對(duì)新輔助化療反應(yīng)性減弱,患者5 年死亡率明顯升高。見表1。

2.2 CXCL16、CXCL6 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示：CXCL6 和CXCL16 在新輔助化療前在癌細(xì)胞中表達(dá)為弱陽性,二者在新輔助化療后在癌細(xì)胞及部分癌周細(xì)胞中表達(dá)為強(qiáng)陽性。Western Blot 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化結(jié)果,對(duì)照組腫瘤中CXCL6 和CXCL16 的水平低于新輔助化療后,見圖1a,1b。與管家基因蛋白GAPDH 相比的相對(duì)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,CXCL6 和CXCL16 在對(duì)照組的表達(dá)分別為(1.25±0.19)、(0.22±0.03),均低于反應(yīng)中度/完全患者的(1.87±0.14)、(0.51±0.07),CXCL16 在反應(yīng)不良及反應(yīng)輕度患者表達(dá)(0.43±0.09)高于對(duì)照組的(0.22±0.03),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CXCL16在反應(yīng)不良/輕度患者的表達(dá)低于反應(yīng)中度/完全患者,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1c,1d。

圖1 新輔助化療不同反應(yīng)組腫瘤組織中CXCL6 及CXCL16 表達(dá)(Western Blot,GAPDH 做內(nèi)參對(duì)照)。

通過對(duì)免疫組化結(jié)果對(duì)新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中CXCL6 和CXCL16 的表達(dá)分析,結(jié)果顯示,術(shù)后癌組織與癌周組織中CXCL6 的0、1、2 級(jí)陽性率分別為(208±26)、(151±39)、(97±26)%均高于術(shù)前的(32±15)、(29±13)、(56±21)%,CXCL16的0、1、2 級(jí)陽性率分別為(228±36)、(198±46)、(123±21)%均高于術(shù)前的(77±27)、(86±38)、(87±32)%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1,2。同時(shí)通過單因素方差分析發(fā)現(xiàn),CXCL6 在新輔助化療治療前及治療后不同反應(yīng)患者之間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。新輔助化療治療效果越好,治療后CXCL6陽性率越高。CXCL16 在新輔助化療治療前不同反應(yīng)患者中的陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而CXCL16 在新輔助化療治療后不同反應(yīng)患者中的陽性率比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),即新輔助化療治療效果越好,治療后CXCL16 陽性率越高。

表1 CXCL6 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況(%,)

表1 CXCL6 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況(%,)

注：與術(shù)前比較,aP<0.05

表2 CXCL16 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況(%,)

表2 CXCL16 在經(jīng)過新輔助化療的大腸腺癌術(shù)前術(shù)后在癌組織及癌周組織中的表達(dá)情況(%,)

注：與術(shù)前比較,aP<0.05

3 討論

既往研究表明,新輔助化療可縮小腫瘤體積,易于根治性手術(shù)切除,減少切緣陽性的可能；同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞術(shù)中脫落風(fēng)險(xiǎn),降低患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,進(jìn)而提高患者的術(shù)后生存率［5］。而作為微觀來看新輔助化療對(duì)癌組織及癌周組織的影響也是巨大的,腫瘤免疫微環(huán)境中的各組分在新輔助治療后均發(fā)生顯著性的改變,例如：瘤細(xì)胞表面與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、腫瘤干細(xì)胞(CSC)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM),其中至關(guān)重要的是TIL,包括CD4、CD8、NKT 等免疫細(xì)胞的改變［6］,這些細(xì)胞增多可局部對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和清除,可能新輔助化療對(duì)癌組織的破壞,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)癌組織的趨化排斥反應(yīng),激活免疫細(xì)胞增多也可達(dá)到地毯式搜索并殺傷撒落血液的癌細(xì)胞,遏制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［7］。

CXCL6 是一種屬于CXC 趨化因子家族的小細(xì)胞因子,也被稱為粒細(xì)胞趨化蛋白2。它通過與趨化因子受體CXC 趨化因子受體1(CXCR1)和CXC 趨化因子受體2(CXCR2)相互作用來誘導(dǎo)其趨化效應(yīng),從而到達(dá)調(diào)控血管生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、微環(huán)境中細(xì)胞生長(zhǎng)和存活以及調(diào)節(jié)局部抗腫瘤活性的作用和腫瘤免疫反應(yīng)［8］。CXCL16 是一種膜結(jié)合趨化因子,一跨膜的形式存在TM-CXCL16 和被蛋白水解酶裂解的可溶性形成SCXCL16,CXCL16 在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、B 細(xì)胞以及各種癌細(xì)胞系表達(dá)［9］。在經(jīng)過新輔助化療后的腫瘤微環(huán)境受到了干擾,引起風(fēng)暴式的炎性反應(yīng),跟免疫炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子也會(huì)被大量的產(chǎn)生。

綜上所述,新輔助化療后大腸癌組織中CXCL6、CXCL16 表達(dá)較治療前明顯升高,且與化療反應(yīng)效果有關(guān),同時(shí)由于新輔助化療效果和患者預(yù)后(5 年生存率)有明確關(guān)系,故也可將CXCL6、CXCL16 在患者腫瘤中的表達(dá)尤其是治療后的表達(dá)情況作為大腸癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。