不同產(chǎn)地梔子HPLC指紋圖譜研究

羅 娜，王 雪，黃麗佳，郭亞東，劉華銀，鄧 亮

(昆明醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

梔子為茜草科植物梔子屬綠灌木的近圓形果實(shí)[1]，其具有悠久的藥食同源歷史．梔子中含有黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、有機(jī)酸酯類等多種化學(xué)成分[2-3]，被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床，如：梔子中的西紅花苷成分具有治療心血管疾病和保護(hù)內(nèi)臟器官等作用[4]；梔子苷具有降血糖、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[5]；梔子中的京尼平苷具有利膽功能，對(duì)防止膽結(jié)石形成有一定的作用[6]．梔子分布廣泛，主產(chǎn)于我國(guó)江西、湖北、福建、湖南、廣西、廣東、云南、四川、貴州等地[7]．由于其化學(xué)成分含量可能與地理環(huán)境因素有關(guān)，造成不同產(chǎn)地的梔子樣品中化學(xué)成分含量不同[8]．因此，本研究建立了梔子HPLC指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以期為梔子的鑒定及質(zhì)量控制提供參考．

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100型)；可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器(VWD)；超聲波清洗器(Grant XUB25)；色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)．

1.2 試藥

梔子苷對(duì)照品(編號(hào)A0178，純度≥98%)，西紅花苷I對(duì)照品(編號(hào)A0211，純度≥ 98%)，西紅花苷II對(duì)照品(編號(hào)A0212，純度≥ 98%),均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，均購自默克股份有限公司；水為超純水；7批不同產(chǎn)地的梔子樣品(表1)均從當(dāng)?shù)刂兴幍曩徺I．

表1 梔子樣品的來源

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫程序見表2，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL．

表2 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱定梔子苷對(duì)照品、西紅花苷I對(duì)照品、西紅花苷II對(duì)照品各10 mg，加入體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液．

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱定各樣品0.2 g，放入具塞錐形瓶里，再精密加入10 mL甲醇(體積分?jǐn)?shù)為70%)，并稱其質(zhì)量，超聲60 min，然后放冷，再稱其質(zhì)量，并補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，將濾液過0.22 μm微孔濾膜，用于HPLC進(jìn)樣分析．

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)梔子樣品，精密稱定，制成供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，并記錄色譜指紋圖譜．結(jié)果顯示，28個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<3%，相對(duì)峰面積的RSD值<5%，說明儀器的精密度較好，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求．

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)梔子樣品，精密稱定，制成供試品溶液，根據(jù)上述色譜條件，在0，2，4，8，12 h進(jìn)樣分析，記錄色譜指紋圖譜．結(jié)果表明，28個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<2%，相對(duì)峰面積的RSD值<2%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，所測(cè)結(jié)果可靠．

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)梔子樣品6份，精密稱定，制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣．結(jié)果表明，28個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值<2%，相對(duì)峰面積的RSD值<5%，說明本方法重復(fù)性較好．

2.4 梔子HPLC指紋圖譜的建立

精密稱定7批梔子樣品，制成供試品溶液，按上述色譜條件，采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立7批樣品的疊加指紋圖譜(圖1)及對(duì)照?qǐng)D譜(圖2)，7批不同產(chǎn)地的梔子共有色譜峰為28個(gè)．通過與對(duì)照品進(jìn)行比較，10號(hào)為梔子苷峰，20號(hào)為西紅花苷I峰，23號(hào)為西紅花苷II峰，見圖3．由于10號(hào)峰梔子苷峰分離效果較好，峰位居中，并且以梔子苷作為梔子的主要有效成分，其含量高，因此選擇梔子苷為參照峰計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，如表3和表4所示，各色譜峰之間的相對(duì)保留時(shí)間差異不大，但相對(duì)峰面積之間存在一定的差異．

2.5 相似度計(jì)算和數(shù)據(jù)分析

由表5可知，不同產(chǎn)地梔子指紋圖譜相似度在0.878～0.982之間，其中：以產(chǎn)地為云南和貴州的梔子差異最大，相似度為0.878；產(chǎn)地為安徽和江西的梔子差異最小，相似度為0.982，表明不同產(chǎn)地間以及生長(zhǎng)條件對(duì)梔子會(huì)有一定的影響．

圖1 7批梔子樣品的HPLC疊加圖譜

圖2 梔子指紋圖譜的對(duì)照?qǐng)D譜

圖3 對(duì)照品HPLC色譜圖

表3 梔子指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 梔子指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

續(xù)表4

表5 不同產(chǎn)地梔子HPLC指紋圖譜的相似度

3 討論

本研究考察了8種提取溶劑30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇，30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、100%乙醇，以及3種不同的提取時(shí)間20，40，60 min．結(jié)果表明，采用70%甲醇超聲提取60 min的提取效果最好．同時(shí)，對(duì)乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水3種流動(dòng)相系統(tǒng)和25，35，40 ℃這3種柱溫進(jìn)行了考察．結(jié)果顯示，在柱溫為35 ℃時(shí)，采用乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)分離效果較好，基線平穩(wěn)，有利于指紋圖譜的分析．此外，考察了238，254，265，330 nm處的特征圖譜，發(fā)現(xiàn)在265 nm處可檢測(cè)出的成分較多且基線平穩(wěn)，因此選用該波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)．

本研究對(duì)7種不同產(chǎn)地梔子樣品建立了指紋圖譜，確定了28個(gè)共有峰，7批梔子樣品的指紋圖譜相似度在0.878～0.982之間，表明不同產(chǎn)地和生長(zhǎng)條件對(duì)梔子有一定的影響．綜上所述，HPLC圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)可為梔子的質(zhì)量控制以及對(duì)其進(jìn)一步研究提供參考．