分析血清外泌體miRNAs在急性腦梗死診斷中的應(yīng)用

付坤，劉華強(qiáng)，王健，王法臣，韓良波，王同新

濰坊市益都中心醫(yī)院神經(jīng)外一科，山東青州 262500

急性腦梗死（ACI）神經(jīng)功能性疾病，局部腦組織缺氧缺血是其致病機(jī)制，經(jīng)緊急救治后，仍有45%左右的殘疾病死率，對人們有生命威脅，需早診治早預(yù)防[1]。急性腦梗死，診斷方式多樣，其中卒中量表評分能對急性腦梗死者神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評估，CT、磁共振成像等能對腦梗死區(qū)域做出準(zhǔn)確觀察，可明確腦血管堵塞情況。但急性腦梗死早期影像學(xué)特征不明顯，很難將缺血病灶準(zhǔn)確地展示出來，而磁共振成像則有使用禁忌，對此，需尋求更敏感的診斷指標(biāo)，以便抓住ACI者的治療時(shí)機(jī)[2]。血清外泌素miRNAs近年得到重視，若存在腦梗死情況，會增加miRNAs表達(dá)水平，且此檢查無創(chuàng)傷性，便于急性腦梗死者進(jìn)行重復(fù)檢測，外泌素miRNAs較高的穩(wěn)定性，能提高ACI者的診斷準(zhǔn)確率[3]。故研究對80例ACI者、80名健康對照者進(jìn)行觀察，旨在評估血清外泌體miR-20b-5p的診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該研究所選病例經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。研究所觀察的樣本是80例ACI者，80名健康對照者，分別歸納為研究組和對照組，研究組：急性腦梗死發(fā)病時(shí)間6～61 h，平均（34.28±2.91）h；年齡47～72歲，平均（59.63±3.26）歲；男42例，女38例。對照組：年齡46～73歲，平均（60.14±3.59）歲；男43名，女37名。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：研究組：納入者均與全國第四屆腦血管學(xué)術(shù)會議制度的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合，且納入者均行CT、MRI檢測，圖像特征和急性腦梗死相同。腦梗死發(fā)病時(shí)間在72 h內(nèi)，且為原發(fā)性腦梗死；納入者或家屬在同意書上簽字。對照組：體檢結(jié)果均正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：短暫性腦缺血者；有惡性腫瘤者；有其他腦出血疾病者；有腦外傷、感染性疾病者、嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌體提取及RNA測定 納入者均行血清外泌體miRNA提取檢測，納入者均行5 mL靜脈血的抽取，在恒溫箱中行30 min的放置后，在4℃的冰箱中保存2 min，離心樣本后，轉(zhuǎn)移上清液至兩個(gè)試管中并標(biāo)記，對樣本行二次離心處理，在EP管中放置上清液，保存在－80℃的冰箱中，后在樣本中加入63μl溶液，均勻混合后，在4℃的環(huán)境中過夜，后對樣本行3次離心處理。對樣本行醋酸雙氧鈾水溶液染色處理，對外泌體形態(tài)進(jìn)行觀察，后經(jīng)納米顆粒跟蹤技術(shù)對外泌體體積進(jìn)行相應(yīng)測定，后經(jīng)CD9抗體、TSG101抗體、羊抗鼠等對納入者外泌體蛋白標(biāo)志物進(jìn)行檢測。各檢測措施完成后，根據(jù)試劑要求，在冰面上放置提取的外泌體RNA，后經(jīng)紫外線對其0D260/0D280值進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算，以計(jì)算結(jié)果對RNA純度、濃度進(jìn)行測定。

1.2.2 miRNA檢測cDNA擴(kuò)增處理經(jīng)All-in-oneTMmiRNA qPCR Ki實(shí)施，此過程中反應(yīng)試劑主要有無RNA酶 水3.6μl、All-in-oneTMmiRNA qPCR Primer2 μl、ROX Reference Dye 0.4μl等，在95℃下對樣本行10 min的預(yù)變性處理，在完成40個(gè)循環(huán)后，行10 s的再次變性，后調(diào)整溫度至60℃，保持20 s后，提高溫度至72℃，對其行10 s的延伸處理即可。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察兩組血清外泌體miR-20b-5ps情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，非連續(xù)性變量表達(dá)方式為中位數(shù)和四分位數(shù)間距，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體觀察結(jié)果

外泌體以球形結(jié)構(gòu)為特征，直徑在100 nm左右；經(jīng)分離處理后，外泌體體積在98 nm左右，CD63、CD81、CD9為外泌體常見陽性標(biāo)志物。見圖1。

圖1 血清外泌體測定結(jié)果

2.2 miR-20b-5p相對表達(dá)量觀察

miR-20b-5p相對表達(dá)量在研究組是3.68，1.57～12.48為其四分位數(shù)間距，而miR-20b-5p相對表達(dá)量在對照組是1.041，0.52～1.81為其四分位數(shù)間距，miR-20b-5p相對表達(dá)量研究組比對照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2。

圖2 兩組miR-20b-5p相對表達(dá)量

3 討論

既往臨床對外泌體認(rèn)識不足，被當(dāng)做是細(xì)胞進(jìn)行廢物排泄的工具，然而研究深入后發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞精密調(diào)控下，外泌體才會得到生產(chǎn)和釋放。外泌體來源內(nèi)細(xì)胞多泡體，在其形成、轉(zhuǎn)移、釋放中參與的蛋白較多，有RAB、ESCRT等，外泌體大小、內(nèi)容物及表面受體的區(qū)別和細(xì)胞來源有相關(guān)性[4]。經(jīng)釋放后，外泌體在精液、血清等體液中均有分布，且能經(jīng)血液向全身組織進(jìn)行轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。在炎癥反應(yīng)、機(jī)體損傷等因素下，外泌體會呈聚集性分布，而在卒中模型研究中，可觀察到腦缺血病灶會出現(xiàn)強(qiáng)烈攝取外泌體的情況，且持續(xù)在缺血區(qū)域出現(xiàn)，濃度始終保持在較高水平，若機(jī)體健康無損傷，外泌體濃度會呈明顯下降趨勢[5]。

歷年研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蛋白質(zhì)、微小核酸核糖等物質(zhì)，外泌體會對血管形成產(chǎn)生影響，且膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)有所改變，在腦梗死重塑過程中有明顯的參與。細(xì)胞微小核酸核糖蛋白質(zhì)、信使RNA等均是外泌體來源，在急性腦梗死進(jìn)展中，會有蛋白質(zhì)、RNAs轉(zhuǎn)移的情況，對其神經(jīng)、血管及膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，對急性腦梗死者細(xì)胞通信功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而作為腦梗死診治的重要指標(biāo)[6]。此外，miRNA還能對急性腦梗死者預(yù)后進(jìn)行判斷，屬潛在生物指標(biāo)，其預(yù)測機(jī)制是miRNA會參與腦缺血的修復(fù)過程[7]。此外，miRNA被臨床歸納為內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，其特點(diǎn)除核苷酸含量多以外，還有較高的保守度，能結(jié)合靶向mRNA者的非翻譯區(qū)，從而對急性腦梗死者生物過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。腦梗死病理進(jìn)展多樣，有粥樣動脈硬化、斑塊破裂、細(xì)胞凋亡等，然miRNA在各病理過程中均發(fā)揮參與作用，且能對血管生成、少突膠質(zhì)生成等發(fā)揮促進(jìn)作用，使其后腦能得到重塑[8]。

miRNA分布廣泛，除在細(xì)胞內(nèi)含量高以外，在體液中也有較高含量，由于其外部存在脂蛋白或外泌體，故有較高的穩(wěn)定性和生物特異性，其濃度會隨疾病出現(xiàn)明顯的變化，有敏感度高、特異度高的特點(diǎn)，且檢測過程較簡單，能對急性腦梗死者做出準(zhǔn)確的判斷[9-10]。外泌體對急性腦梗死者的影響，主要體現(xiàn)在miRNA的傳遞，其能自由通過血腦屏障，且有較高的穩(wěn)定性，能對腦梗死進(jìn)展過程進(jìn)行影響。有研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體于急性腦梗死者而言，miRNA表達(dá)會出現(xiàn)較大變化，其中增長趨勢明顯的即是促癌miRNA。在該研究的檢測中，miRNA始終有外泌體的保護(hù)，能對血液RNA酶的降解進(jìn)行預(yù)防，使其穩(wěn)定性提高，且其介導(dǎo)細(xì)胞通訊功能，可對靶細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行抑制[11]。而在急性腦梗死者的各項(xiàng)檢查中，外泌體miRNA檢測有無創(chuàng)傷的特點(diǎn)，僅經(jīng)血液樣本獲取便能進(jìn)行檢測，重復(fù)性強(qiáng)，敏感度高，經(jīng)濟(jì)性高，相比傳統(tǒng)活檢、CT、MRI等更值得使用[12]。經(jīng)血清外泌體miRNAs的檢測后可發(fā)現(xiàn)，miR-20b-5p相對表達(dá)量在研究組比對照組高。此研究結(jié)果表明，miR-20b-5p能對急性腦梗死做出相對準(zhǔn)確的判斷，以其數(shù)值為依據(jù)，還能對急性腦梗死的進(jìn)展進(jìn)行預(yù)測，繼而對治療措施進(jìn)行調(diào)節(jié)，使急性腦梗死者預(yù)后改善。

綜上所述，急性腦梗死病理特征明確，經(jīng)血清外泌體miRNAs能對其做出準(zhǔn)確的判斷，可為急性腦梗死預(yù)防、診治提供參考。