不同保護(hù)劑對(duì)大鼠腎臟凍融法脫細(xì)胞的影響

羅嗣昌，胥義

上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海200093

前言

器官移植已成為治療器官疾病末期最有效的方法之一，每年都能拯救無(wú)數(shù)的患者。但當(dāng)前供體器官不足的共性問(wèn)題導(dǎo)致許多患者在等待供體過(guò)程中死亡［1］。另外，異體移植也可能因免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，致使移植患者需要長(zhǎng)期服用免疫抑制劑［2］。隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，利用干細(xì)胞與器官支架再生器官可能能夠成為器官移植的來(lái)源［3‐4］。Meezan等［5］首先提出去污劑脫細(xì)胞的方法，并證實(shí)脫細(xì)胞后的細(xì)胞外基質(zhì)能保留超微結(jié)構(gòu)的不溶性成分。Ott等［6］通過(guò)在脫細(xì)胞大鼠腎臟接種干細(xì)胞構(gòu)建具有一定功能的腎臟，讓再生腎臟作為供體器官成為可能。脫細(xì)胞支架已將細(xì)胞及DNA 等物質(zhì)洗脫干凈，再生器官后能夠避免腎臟移植所引發(fā)的免疫抗原反應(yīng)［7‐9］。

常用的脫細(xì)胞方法有洗脫劑洗脫法［10］、酶處理法［11］、凍融法［12］等。離子型洗脫劑SDS對(duì)細(xì)胞的洗脫效果較好，但同時(shí)會(huì)將腎臟內(nèi)的許多其他物質(zhì)一起洗脫，造成細(xì)胞外基質(zhì)各成分的損失［13］；非離子型洗脫劑Triton‐100對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的損傷較小，但細(xì)胞的洗脫效果不佳，很難將腎臟內(nèi)部的細(xì)胞成分完全洗脫干凈［14］。酶解法利用生物酶進(jìn)行洗脫工藝處理，但研究表明，盡管酶解法能夠特異性去除細(xì)胞中DNA等成分，其單獨(dú)洗脫效果不好［15］。凍融法脫細(xì)胞利用凍融過(guò)程溶解細(xì)胞，再通過(guò)洗脫劑進(jìn)行細(xì)胞的洗脫。凍融法能更有效地溶解組織和器官內(nèi)的細(xì)胞，凍融過(guò)程不會(huì)顯著增加組織中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的損失［12］。但有研究表明，凍融過(guò)程中出現(xiàn)的冰晶、產(chǎn)生的熱應(yīng)力等都可能影響生物組織凍融后的結(jié)構(gòu)完整性［16‐17］。常采用添加低溫保護(hù)劑的方式來(lái)控制冰晶生長(zhǎng)，并成功應(yīng)用于多種生物材料低溫保存過(guò)程［18‐20］。滲透性低溫保護(hù)劑甘油和二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide,DMSO）是當(dāng)前低溫保存中非常常見的低溫保護(hù)劑，能夠幫助一些生物材料在一定低溫條件下長(zhǎng)時(shí)間保存；而海藻糖和麥芽糖作為非滲透性冷凍保護(hù)劑，越來(lái)越多的科學(xué)家將之用于低溫生物領(lǐng)域。但從文獻(xiàn)調(diào)研來(lái)看，不同保護(hù)劑輔助凍融脫細(xì)胞目前主要是在肝臟凍融法脫細(xì)胞方面取得較好效果［12］，而腎臟凍融法脫細(xì)胞方面鮮有應(yīng)用和探討。

鑒于此，本研究初步探索幾種常用的保護(hù)劑及濃度對(duì)大鼠腎臟凍融法脫細(xì)胞支架的血管網(wǎng)絡(luò)完整性、DNA 殘留、細(xì)胞外基質(zhì)的保留和力學(xué)性能等影響，有望為后續(xù)腎臟凍融法脫細(xì)胞工藝優(yōu)化提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

成年雄性SD 大鼠48只（上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)），體質(zhì)量200 g 左右，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。磷酸鹽溶液（PBS）（上海勵(lì)瑞生物科技有限公司），甘油（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DMSO（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），海藻糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），麥芽糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Triton X‐100（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Microfil造影劑（美國(guó)Flow Tech 公司），HE 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），Masson 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），Weigert 染色盒（上海賽新生物科技有限公司），彈性蛋白抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司），三羥甲基氨基甲烷（Tris‐Hcl）（上海勵(lì)瑞生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫細(xì)胞方法實(shí)驗(yàn)組分為未添加保護(hù)劑組、10%v/v甘油組（溶媒為雙蒸水）、10%v/v DMSO組（溶媒為培養(yǎng)基）、5%w/v麥芽糖組（溶媒為PBS）、5%w/v海藻糖組（溶媒為PBS），新鮮組未經(jīng)凍融法脫細(xì)胞過(guò)程處理。

利用麻醉劑將實(shí)驗(yàn)大鼠深度麻醉后通過(guò)十字解剖法露出腹腔，并將左腎及主動(dòng)靜脈裸露，進(jìn)行主動(dòng)脈插管，沖洗血液后灌注保護(hù)劑，將大鼠腎臟解剖離體，然后放置于‐20 ℃冰箱中進(jìn)行冷凍。12 h 后在37 ℃溫水中進(jìn)行水浴復(fù)溫，然后利用蠕動(dòng)泵對(duì)腎臟用0.3%Triton X‐100 以0.4 mL/min 的流速灌注24 h，PBS灌注2 h。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析方法（1）血管造影。利用造影劑對(duì)大鼠腎臟血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行固化，并利用CT 進(jìn)行掃描，通過(guò)CT 三維重構(gòu)評(píng)估凍融法脫細(xì)胞腎臟血管網(wǎng)絡(luò)完整性及血管損傷情況。（2）染色切片及免疫組化。利用HE 染色切片檢測(cè)脫細(xì)胞支架DNA 殘留情況，利用Masson 染色切片和免疫組化檢測(cè)膠原及彈性蛋白保留情況［21］。（3）蛋白質(zhì)定量分析。利用考馬斯亮藍(lán)法定量檢測(cè)凍融法脫細(xì)胞腎臟支架蛋白質(zhì)的含量。（4）力學(xué)性能分析。利用動(dòng)態(tài)力學(xué)分析儀（Dynamic Mechanical Analyzer,DMA）對(duì)大鼠凍融法脫細(xì)胞腎臟支架進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試，通過(guò)壓力測(cè)試曲線得出樣本的彈性模量，從而評(píng)估凍融法脫細(xì)胞大鼠腎臟支架力學(xué)性能。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同保護(hù)劑對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)完整性的影響

血管網(wǎng)絡(luò)完整性檢測(cè)是利用造影劑灌注進(jìn)入腎臟內(nèi)部血管，待造影劑固化后利用CT掃描觀察從而得到血管網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。圖1a為大鼠腎臟新鮮對(duì)照組血管網(wǎng)絡(luò)，從中可以清晰地看到正常大鼠腎臟完整的血管網(wǎng)絡(luò)；圖1b為不加載保護(hù)劑的凍融脫細(xì)胞腎臟支架血管網(wǎng)絡(luò)，可以發(fā)現(xiàn)其血管網(wǎng)絡(luò)損傷比較嚴(yán)重；加載10%甘油和5%麥芽糖這兩組的血管網(wǎng)絡(luò)也都損傷比較嚴(yán)重；但10%DMSO和5%海藻糖這兩組的血管網(wǎng)絡(luò)相對(duì)比較完整。其中甘油和DMSO為滲透性保護(hù)劑，麥芽糖和海藻糖為非滲透性保護(hù)劑。從血管造影結(jié)果來(lái)看，加載不同保護(hù)劑對(duì)凍融法脫細(xì)胞支架的血管網(wǎng)絡(luò)作用效果不同，不同類型保護(hù)劑均有可能對(duì)凍融法脫細(xì)胞支架血管網(wǎng)絡(luò)有保護(hù)劑作用。

圖1 加載不同保護(hù)劑大鼠腎臟凍融脫細(xì)胞支架的血管造影Fig.1 Angiography of the decellularization scaffolds of rat kidney obtained by freeze-thaw method with different cryoprotective agents

2.2 不同保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞及DNA殘留的影響

HE 染色是一種能夠判定組織中是否還殘留DNA 及細(xì)胞核等物質(zhì)的重要手段。如圖2所示，新鮮組的HE 染色能看到完整的細(xì)胞核；未添加保護(hù)劑組藍(lán)色區(qū)域較多，但基本沒(méi)有成形的細(xì)胞核，說(shuō)明凍融過(guò)程基本將細(xì)胞溶解了；10%甘油組視野內(nèi)基本看不到細(xì)胞核但仍存在部分藍(lán)色區(qū)域；10%DMSO 組也存在較多的藍(lán)色區(qū)域，說(shuō)明支架內(nèi)還殘留比較多DNA 成分；5%麥芽糖組藍(lán)色區(qū)域比較明顯；5%海藻糖組視野內(nèi)基本看不到細(xì)胞核且藍(lán)色區(qū)域較少，說(shuō)明脫細(xì)胞效果較好。從HE 染色切片來(lái)看，5%海藻糖DNA 殘留相對(duì)最少，即加載5%海藻糖組的脫細(xì)胞效果最好。從血管網(wǎng)絡(luò)來(lái)看，10%DMSO 和5%海藻糖的保存最為完整，但5%海藻糖脫細(xì)胞效果更好，這說(shuō)明在加載不同保護(hù)劑的凍融法脫細(xì)胞方案中，血管網(wǎng)絡(luò)更加完整并不意味著脫細(xì)胞效果更好。在本研究中，5%海藻糖在血管網(wǎng)絡(luò)保存比較完整的同時(shí)其脫細(xì)胞效果也相對(duì)較好。

圖2 大鼠腎臟凍融脫細(xì)胞前后的HE染色（×100）Fig.2 HE staining of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

2.3 不同保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的影響

Masson染色是檢測(cè)膠原纖維含量的一個(gè)重要方法。其中膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。圖3所示為新鮮對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組的Masson染色切片結(jié)果。將新鮮對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，在不加載保護(hù)劑和加載不同保護(hù)劑的條件下，Masson染色的藍(lán)色著色區(qū)域大小基本相同。凍融法脫細(xì)胞的凍融過(guò)程對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的損傷是有限的，即使多次凍融也不會(huì)增加其損傷［12］。非離子型洗脫劑Triton‐100的洗脫過(guò)程對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量的損傷也是非常小的。所以凍融法脫細(xì)胞能比較完好地保留大鼠腎臟的膠原，加載保護(hù)劑與否，凍融法脫細(xì)胞也不會(huì)造成膠原含量的損傷。

圖3 大鼠腎臟凍融脫細(xì)胞前后的Masson染色（×100）Fig.3 Masson staining of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

免疫組化能夠?qū)μ禺愋缘鞍走M(jìn)行著色，從而檢測(cè)特異性蛋白的含量。本實(shí)驗(yàn)利用彈性蛋白抗體對(duì)大鼠腎臟脫細(xì)胞支架進(jìn)行彈性蛋白免疫組化染色。彈性蛋白是維持脫細(xì)胞支架正常形態(tài)的重要成分，在后續(xù)的再細(xì)胞化再生器官中起著非常重要的作用。如圖4所示，通過(guò)對(duì)新鮮對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組結(jié)果觀察可以發(fā)現(xiàn)，加載不同保護(hù)劑的彈性蛋白染色區(qū)域大小基本相同。這與Masson切片染色結(jié)果是相同的，說(shuō)明凍融法脫細(xì)胞的凍融過(guò)程對(duì)彈性蛋白的損傷也是有限的。凍融法脫細(xì)胞對(duì)彈性蛋白的含量也不會(huì)造成損傷。

圖4 大鼠腎臟凍融脫細(xì)胞前后彈性蛋白免疫組化（×100）Fig.4 Elastin immunohistochemistry of rat kidneys before and after freeze-thaw decellularization (×100)

通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)。如圖5所示，通過(guò)對(duì)新鮮對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行誤差分析可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與新鮮組均存在顯著性差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組在凍融脫細(xì)胞過(guò)程中還存在一定的蛋白質(zhì)損失，導(dǎo)致這個(gè)結(jié)果可能是因?yàn)樵趦鋈诜摷?xì)胞后細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)與細(xì)胞及DNA等物質(zhì)一起被灌注洗脫出腎臟。但兩者并沒(méi)有數(shù)量級(jí)上的差異，且除新鮮對(duì)照組外其他實(shí)驗(yàn)組之間的蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)不存在顯著性差異，這說(shuō)明在凍融及Triton X‐100 灌注洗脫過(guò)程中蛋白質(zhì)并沒(méi)有發(fā)生明顯的損失。脫細(xì)胞支架內(nèi)部的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的完整對(duì)后續(xù)的再細(xì)胞化有著十分重要的作用。從當(dāng)前結(jié)果來(lái)看，凍融法脫細(xì)胞能基本保留大鼠腎臟細(xì)胞外基質(zhì)大部分蛋白質(zhì)等物質(zhì)。

圖5 新鮮對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)定量檢測(cè)（重復(fù)實(shí)驗(yàn)組數(shù)n=3）Fig.5 Quantitative detection of protein contents in control group and experimental groups(the number of repeated experimental groups was 3)

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本的膠原染色、彈性蛋白免疫組化以及蛋白質(zhì)定量可知凍融脫細(xì)胞大鼠腎臟支架的膠原、彈性蛋白以及所有蛋白質(zhì)等細(xì)胞外基質(zhì)成分基本能夠得到完整保留。細(xì)胞外基質(zhì)的完整保留對(duì)再細(xì)胞化有著非常重要的作用，有利于再生器官的制備。

2.4 不同保護(hù)劑對(duì)力學(xué)性能的影響

圖6為利用DMA 所得壓力曲線，圖7為通過(guò)數(shù)據(jù)計(jì)算所得彈性模量。對(duì)比圖7各組彈性模量數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，新鮮對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組與之間存在著顯著性差異，說(shuō)明大鼠腎臟經(jīng)過(guò)凍融法脫細(xì)胞處理以后其內(nèi)部力學(xué)性能發(fā)生了較大的變化。其中，滲透性保護(hù)劑中DMSO 組的彈性模量數(shù)據(jù)相對(duì)比甘油組的結(jié)果要好，非滲透性保護(hù)劑中海藻糖組相比麥芽糖組結(jié)果好。這與血管網(wǎng)絡(luò)完整性的規(guī)律是一致的，說(shuō)明可能大鼠腎臟脫細(xì)胞支架網(wǎng)管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越完整，其力學(xué)性能會(huì)更好。對(duì)比DMSO 和海藻糖組的數(shù)據(jù)可以知道，10%DMSO 組的彈性模量略微大于5%海藻糖組。從HE染色結(jié)果可知，10%DMSO組的細(xì)胞及DNA 殘留相對(duì)更多，這可能是造成10%DMSO 組彈性模量大于海藻糖組的原因。大鼠腎臟脫細(xì)胞支架內(nèi)部細(xì)胞的洗脫和血管網(wǎng)絡(luò)受到一定的損傷，可能是其力學(xué)性能發(fā)生變化的主要原因。通過(guò)對(duì)不同保護(hù)劑的力學(xué)性能分析可知，凍融脫細(xì)胞支架相較于新鮮腎臟，其力學(xué)性能會(huì)發(fā)生較大變化。結(jié)構(gòu)更加完整的脫細(xì)胞支架更有利于再生成再生器官，但力學(xué)性能的變化會(huì)與脫細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)有怎樣的相關(guān)性，還需進(jìn)一步研究。

圖6 新鮮對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組壓力曲線Fig.6 Pressure curves of control group and experimental groups

圖7 新鮮對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組及彈性模量（重復(fù)實(shí)驗(yàn)組數(shù)n=3）Fig.7 Elastic modulus of control group and experimental groups(the number of repeated experimental groups was 3)

3 結(jié)論

本研究利用加載兩種滲透性和兩種非滲透性保護(hù)劑來(lái)探索不同保護(hù)劑對(duì)大鼠腎臟凍融脫細(xì)胞的影響。通過(guò)CT 三維重構(gòu)，發(fā)現(xiàn)滲透性保護(hù)劑10%DMSO和非滲透性保護(hù)劑5%海藻糖對(duì)凍融脫細(xì)胞支架的血管網(wǎng)絡(luò)均能保存得比較完整。但通過(guò)HE染色切片發(fā)現(xiàn)，5%海藻糖對(duì)細(xì)胞的洗脫效果更好，10%DMSO和10%甘油、5%麥芽糖的洗脫效果較差。從Masson切片染色和彈性蛋白免疫組化及蛋白質(zhì)定量檢測(cè)來(lái)看，凍融法脫細(xì)胞支架的細(xì)胞外基質(zhì)成分基本能完整保留。綜合來(lái)看，加載5%海藻糖的凍融法脫細(xì)胞能夠制備更好的脫細(xì)胞支架，有望成為再細(xì)胞化的脫細(xì)胞支架材料。

通過(guò)加載低溫保護(hù)劑來(lái)輔助凍融法脫細(xì)胞是因?yàn)榈蜏乇Ｗo(hù)劑對(duì)生物材料在低溫條件下有抑制冰晶的作用。但凍融法脫細(xì)胞要利用冰晶溶解細(xì)胞，同時(shí)也要利用低溫保護(hù)劑保護(hù)大鼠腎臟內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)等結(jié)構(gòu)。雖然本研究對(duì)不同保護(hù)劑輔助凍融脫細(xì)胞進(jìn)行了分析，但還不能完全避免器官內(nèi)部血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的損傷并將細(xì)胞洗脫干凈，還需要更深入地研究低溫保護(hù)劑種類及濃度和凍融工藝對(duì)凍融法脫細(xì)胞腎臟支架的影響。