葡萄胎組織中ING4蛋白表達及與微血管密度的關(guān)系

徐小燕，龐義存，馬曉琳，郝紅娟

(1.河北生殖婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050090；2.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050051)

葡萄胎(hydatidiform mole，HM)是妊娠滋養(yǎng)細胞疾病中最常見的一種病變，分為完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole，CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole,PHM)。葡萄胎的病因研究已取得一些進展，但確切病因不明，發(fā)病及惡變機制尚不明確，有待進一步研究。目前臨床預測惡變主要依據(jù)高危因素，包括妊娠年齡>40歲、血清絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)值過高(≥105U/L)、子宮體積大于停經(jīng)月份、重復性葡萄胎等，據(jù)此采取預防性化療及預防性子宮切除術(shù)，以預防惡變，但預防性干預目前仍存在爭議。生長抑制因子4(inhibitor of growth family member 4，ING4)基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種活性較強的候選抑癌基因，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。微血管密度(microvessel density,MVD)是評價腫瘤內(nèi)微血管增殖狀況的金指標，CD34是形成血管再生上皮細胞的一個標志物。本研究通過檢測葡萄胎組織中ING4蛋白表達及與MVD的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年11月—2017年11月河北生殖婦產(chǎn)醫(yī)院婦科門診人工流產(chǎn)所得正常早孕絨毛標本20例為正常早孕絨毛組，年齡21～48歲，平均(32.45±11.02)歲，患者均<12孕周，且無異常妊娠疾病史。選取河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院2010年11月—2017年11月病理資料完整的葡萄胎患者清宮標本30例為葡萄胎組，年齡21～53歲，平均(32.77±10.20)歲，所有標本均經(jīng)病理學檢查確診為葡萄胎)。其中CHM 14例，PHM 16例，惡變?yōu)榍治g性葡萄胎者3例。無高危因素5例，有高危因素25例。年齡≤40歲23例，>40歲7例；血清HCG≤105U/L 9例，>105U/L 21例；子宮大小≤孕周16例，>孕周14例；有重復性葡萄胎病史2例。所有患者均未行清宮術(shù)前化療。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑與方法 鼠抗人原始造血細胞CD34單克隆抗體，PV6002山羊抗小鼠二步法免疫組織化學檢測試劑，PV6001兔二步法免疫組織化學檢測試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。兔抗人ING4多克隆抗體購自美國Proteintech Group有限公司。

免疫組織化學PV法檢測組織中ING4蛋白的表達：收集的標本經(jīng)多聚甲醛固定保存，進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，厚約4 μm。采用免疫組織化學PV6001法染色，按PV法說明書進行操作。4%中性甲醛固定，石蠟包埋，3 μm切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色。結(jié)果判斷：以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)代替一抗作為陰性對照。ING4蛋白陽性表達以細胞核和(或)胞漿內(nèi)出現(xiàn)染色顆粒為標準，采用半定量積分法判定結(jié)果。先按染色強度評分：未見染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按染色細胞所占百分比評分，隨機選取高倍鏡(×200)下觀察4個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，無染色細胞為0分，染色細胞≤25%為1分，染色細胞26%～50%為2分，染色細胞>50%為3分。將兩者評分之和所得總分進行結(jié)果判定：總分>2分定義為陽性表達，總分≤2分定義為陰性表達。切片均有2名病理醫(yī)生采用雙盲法分別對同一切片強度評定。

免疫組織化學PV法檢測組織中的MVD：收集的標本經(jīng)中性福爾馬林液固定保存，進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，厚約4 μm。采用免疫組織化學PV6002法染色，按PV法說明書進行操作。結(jié)果判斷：CD34陽性表達定位于血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)或胞膜，用于標記并計數(shù)MVD。MVD計數(shù):滋養(yǎng)細胞間質(zhì)內(nèi)血管內(nèi)皮細胞或細胞族代表1條單獨的微血管；如果主要結(jié)構(gòu)不相連，分支結(jié)構(gòu)也作為一個血管計算，凡管腔>8個紅細胞直徑或肌層較厚者不列入計數(shù)；先在低倍(×40、×100)顯微鏡視野內(nèi)觀察整張切片的血管分布情況，找到病變組織內(nèi)微血管密度最高的區(qū)域(熱點區(qū))，然后在高倍(×200)顯微鏡視野內(nèi)計數(shù)4個區(qū)域微血管的數(shù)目，求其平均值作為該張組織切片的MVD值。分辨不清或染色模糊的細胞不計入計數(shù)結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，兩組變量間的相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中ING4蛋白表達 早孕絨毛中ING4蛋白主要表達于滋養(yǎng)細胞的細胞核，少許表達于細胞質(zhì)，多呈強陽性表達；葡萄胎組織中ING4蛋白大部分表達于滋養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)，小部分表達于細胞核，滋養(yǎng)細胞間質(zhì)未見ING4蛋白表達。正常早孕絨毛中ING4蛋白表達陽性率100%(30/30)，葡萄胎組織中ING4蛋白表達陽性率50%(15/30)，葡萄胎組ING4蛋白表達低于正常早孕絨毛組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.286,P<0.05)。見圖1,2。

圖1 ING4蛋白在正常早孕絨毛中的表達(免疫組織化學 ×200)

2.2不同臨床高危因素及病理類型中ING4蛋白表達 CHM組和PHM組中ING4蛋白表達均低于正常早孕絨毛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CHM組和PHM組的ING4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。無高危因素組與有高危因素組ING4蛋白表達均低于正常早孕絨毛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。無高危因素與有高危因素組ING4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素分析結(jié)果表明，葡萄胎組織中ING4蛋白表達與臨床高危因素無關(guān)(P>0.05)。見表1～3。

圖2 ING4蛋白在葡萄胎中的表達(免疫組織化學 ×200)

表1 不同葡萄胎病理類型及正常早孕絨毛中ING4蛋白表達Table 1 Expression of ING4 protein in patients with different pathological types of hydatidiform mole and in chorionic villi of normal early pregnancy (例數(shù))

表2 有無高危因素葡萄胎組織中ING4蛋白表達Table 2 Expression of ING4 protein in hydatidiform mole tissue with or without high-risk factors (例數(shù))

2.3正常早孕絨毛及葡萄胎組織中MVD測定 在正常早孕絨毛間質(zhì)中見較多CD34標記的微血管，見圖3。葡萄胎組織標本中CD34標記的微血管明顯減少。完全性葡萄胎絨毛間質(zhì)分隔為大小不等的水池，在水池內(nèi)偶見微血管，見圖4。部分性葡萄胎中水腫絨毛與正常絨毛并存，水腫絨毛間質(zhì)中CD34表達減少，正常絨毛部分間質(zhì)CD34表達與正常早孕絨毛相似，見圖5。正常早孕絨毛組MVD值高于葡萄胎組MVD值，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.535,P<0.05)。

表3 不同臨床高危因素葡萄胎組織中ING4蛋白表達Table 3 Expression of ING4 protein in hydatidiform mole tissues with different clinical high-risk factors (例數(shù))

圖3 正常早孕絨毛中CD34 標記的MVD(免疫組織化學 ×200)

2.4不同高危因素及病理類型中MVD測定 PHM組和CHM組MVD值均小于正常絨毛組，PHM組高于CHM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。無高危因素組和有高危因素組MVD值均小于正常絨毛組，有高危因素組高于無高危因素組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單因素分析結(jié)果表明，葡萄胎組織中MVD值與臨床高危因素無關(guān)(P>0.05)。見表4～6。

表4 不同葡萄胎病理類型及正常早孕絨毛中MVD比較Table 4 Comparison of MVD in patients with different pathological types of hydatidiform mole and in chorionic villi of normal early pregnancy

2.5葡萄胎組織中ING4蛋白表達與MVD的關(guān)系 葡萄胎組織中ING4蛋白表達與MVD無相關(guān)性(rs=0.137，P=0.470)。

2.6惡變的葡萄胎組織中ING4蛋白表達及MVD 惡變組ING4 蛋白表達低于未惡變組，MVD蛋白表達高于未惡變組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表7。

表5 有無高危因素葡萄胎組織中MVD比較Table 5 Comparison of MVD in hydatidiform mole with or without high-risk factors

表6 不同臨床高危因素葡萄胎組織中MVD比較Table 6 Comparison of MVD in hydatidiform mole tissues with different clinical high-risk factors

表7 是否惡變葡萄胎組織中ING4蛋白表達Table 7 Expression of ING4 protein in patients with or without malignant hydatidiform mole tissue

3 討 論

葡萄胎雖屬良性病變，但具有潛在惡變的危險，且有5.0%～15.0%可能發(fā)展成妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤[1]。葡萄胎的發(fā)病及惡變機制尚不明確，尚無很好的方法預測惡變，傳統(tǒng)病理學分類也很難作為葡萄胎性質(zhì)及預后的判斷，而且一旦惡變很早就可通過血運轉(zhuǎn)移，因此早期預測惡變是葡萄胎處理需要解決的重要任務(wù)。

正常妊娠滋養(yǎng)細胞本身具有一定浸潤性，但侵入過程受到母體嚴格精細調(diào)控，即侵入具有節(jié)制性，成為葡萄胎后的滋養(yǎng)細胞侵襲能力明顯增強。研究表明從葡萄胎、侵蝕性葡萄胎到發(fā)展成絨毛膜癌，很可能是一個疾病發(fā)展的不同階段。ING4作為一種活性較強的候選抑癌基因,在正常組織中表達豐富，而在腫瘤組織中表達異常或發(fā)生突變。研究表明ING4在許多與癌癥相關(guān)的細胞進程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個過程。ING4能夠增強P53的活性、誘導細胞凋亡和促進p21表達、抑制接觸抑制的喪失、調(diào)節(jié)細胞周期、參與染色質(zhì)重塑，此外，ING4還抑制缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的穩(wěn)定性和活性，并抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF- κB)的p65亞基與p65亞基相互作用調(diào)節(jié)腫瘤的生長和血管的生成[2]。

ING4蛋白是一種細胞核因子，主要定位于細胞核，目前研究顯示在ING4蛋白的中部有二聯(lián)的核定位信號區(qū)域(nuclear localization signal,NLS)，其介導ING4蛋白的核定位以及ING4與P53在細胞核內(nèi)的復合定位外，并且在ING4和p53的相互結(jié)合中起關(guān)鍵作用，ING4基因缺乏核定位信號后將失去其負調(diào)節(jié)細胞增殖，細胞擴散和細胞遷移能力。ING4與p53的相互作用也將被廢除，并且下調(diào)p53所誘導的p21表達上調(diào)[3]。本研究顯示與正常絨毛相比葡萄胎組織中出現(xiàn)了較多ING4蛋白的異位表達，這種異位表達可能將導致其功能改變，干擾ING4與p53的相互作用，與張蕾等[4]的Meta分析結(jié)論一致，p53高表達可能在亞洲人的HM形成及發(fā)展過程中起重要作用，吳齊斌等[5]研究結(jié)果提示p53基因突變在滋養(yǎng)細胞腫瘤發(fā)病及惡性進展中起重要作用。目前一系列研究表明ING4基因在多種腫瘤中易發(fā)生缺失突變和(或)表達下調(diào)，包括膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌[6]，頭頸部癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌[7]、卵巢癌[8]、子宮內(nèi)膜癌[9]等，并與腫瘤發(fā)生及腫瘤惡性程度密切相關(guān)[10]。本研究結(jié)果說明在葡萄胎的發(fā)病過程中ING4蛋白的表達明顯被抑制，雖然葡萄胎是良性病變，但有惡變傾向，符合ING4基因抑癌功能的相關(guān)結(jié)論。ING4蛋白的異位表達及降低促進了葡萄胎的發(fā)病。本研究結(jié)果顯示，CHM組與PHM組中ING4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，也說明傳統(tǒng)的病理學分類很難作為葡萄胎性質(zhì)及預后的判斷標準，且均有發(fā)展成為妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤的可能。無高危因素與有高危因素組ING4蛋白表達均低于早孕絨毛組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。無高危因素與有高危因素組ING4蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素分析結(jié)果表明，葡萄胎組織中ING4蛋白表達與患者年齡、血清HCG水平、子宮大小及是否重復性葡萄胎無關(guān)。孫旭凌等[11]研究ING4在結(jié)直腸癌中的表達顯示，ING4陽性表達與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度無關(guān)，但與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，并且證實ING4是結(jié)直腸癌預后的獨立危險因素之一。本研究結(jié)果提示ING4蛋白的表達水平與葡萄胎臨床高危因素并不一致，說明臨床高危因素預測惡變，具有一定的參考價值但準確性不高。研究中有3例葡萄胎惡變?yōu)榍治g性葡萄胎，惡變率10%，3例惡變者ING4蛋白表達均為陰性，未惡變組ING4蛋白表達陽性率52%，惡變組與未惡變組ING4蛋白表達相比呈現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示ING4目前還不能作為葡萄胎惡變的分子標志物之一，可能與病例數(shù)較少有關(guān)，且有部分高?；颊咝蓄A防性子宮切除術(shù)及選擇性化療降低了惡變率。需擴大樣本量以進一步研究。

微血管增生是很多腫瘤的特征，MVD是目前檢測腫瘤血管形成活性的重要指標。研究表明ING4基因在多種腫瘤中能夠抑制腫瘤血管形成進而抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，ING4基因是血管形成重要的調(diào)節(jié)因素。其作用機制可能和白細胞介素8及低氧誘導因子1等有關(guān)[12]。本研究結(jié)果與郭虹等[13]及李富亮等[14]研究結(jié)論一致，葡萄胎中CD34表達顯著低于正常妊娠組織。葡萄胎與正常妊娠組織不同病理改變在于絨毛間質(zhì)血管明顯減少。目前研究認為葡萄胎存在受精缺陷，葡萄胎血管發(fā)育障礙導致胚胎死亡，由于血管減少及缺失致內(nèi)循環(huán)停止，無法輸出,以至發(fā)生液體儲留,形成葡萄胎。本研究表明不同臨床高危因素中MVD測定：無高危因素與有高危因素組分別與早孕絨毛組相比MVD值均低于早孕絨毛組(P<0.05)。無高危因素與有高危因素組MVD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素分析結(jié)果表明，葡萄胎組織中MVD值與患者年齡、血清HCG、子宮大小及是否重復性葡萄胎無關(guān)。葡萄胎組織中ING4蛋白表達與MVD值二者呈正相關(guān)，但相關(guān)性不大，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此結(jié)果與ING4在多種腫瘤中表現(xiàn)出的抑制腫瘤血管形成，與腫瘤血管形成呈負相關(guān)不一致，推測在葡萄胎中可能存在擬血管形成，因滋養(yǎng)細胞與血管內(nèi)皮細胞同性，且滋養(yǎng)細胞可以取代血管內(nèi)皮細胞組成血管壁內(nèi)層[15]，這種血管生成方式與經(jīng)典的血管生成方式完全不同，不依賴內(nèi)皮細胞，傳統(tǒng)的內(nèi)皮細胞標志物染色通常為陰性，非內(nèi)皮細胞襯覆的微循環(huán)管腔在正常成熟組織中并不存在，但可見于正常胚胎組織，滋養(yǎng)細胞在參與人胎盤及原始微循環(huán)形成過程中可獲得血管內(nèi)皮細胞表型，該現(xiàn)象稱之為擬血管形成。3例惡變組中ING4蛋白表達與MVD呈負相關(guān)，與ING4在其他腫瘤中表現(xiàn)出的抑制腫瘤血管形成，與腫瘤血管形成呈負相關(guān)結(jié)論一致。葡萄胎與正常早孕絨毛相比滋養(yǎng)細胞有程度不等的增生，是否在葡萄胎中存在擬血管形成這種血管形成方式及ING4蛋白表達抑制是否促進葡萄胎的惡變均有待擴大樣本量進一步研究。