增強(qiáng)自噬水平對(duì)腦缺血預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的影響

孫 原，侯曉冬，楊延雯，李艷玲，李 弘，石秋艷

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市人民醫(yī)院病案科，河北 唐山 063001)

缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning)是器官的短期缺血適應(yīng)，可以在永久性缺血壞死之前起到保護(hù)作用，但完整的分子機(jī)制仍不明確[1]。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡激活在缺血預(yù)處理后均被抑制。近年來有研究提出，自噬也許參與了缺血預(yù)處理的重要環(huán)節(jié)來減輕神經(jīng)損傷[2]。本研究通過制作大鼠缺血再灌注模型，并對(duì)部分大鼠事先進(jìn)行缺血預(yù)處理，探索自噬在大鼠腦缺再灌注損傷中的具體作用及可能的分子機(jī)制。進(jìn)一步為腦缺血的防治提供可能策略。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 選擇中國解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所的Sprague-Dawley雄性大鼠(8～9周齡，0.23～0.27 kg)。實(shí)驗(yàn)前大鼠處于12/12 h明/暗周期，并維持40%～60%相對(duì)濕度、(23±2)℃溫度，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲得標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物飼料和自來水。依照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將100只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、缺血再灌注組(B組)，缺血預(yù)處理組(C組)，缺血再灌注+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)組(D組)，缺血預(yù)處理+3-MA組(E組)，每組20只。2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并為保持其體溫在37 ℃，將其置于加熱墊上。

1.2試劑 TTC染色液(上海信帆生物科技有限公司)，3-MA(Sigma，美國)，全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物)，磷酸鹽緩沖液(PBS，賽默飛公司，美國)，兔抗鼠 Beclin-1、兔抗鼠LC3-Ⅱ(Cell Signaling，美國)，GAPDH(Kangchen，美國)，Western blot 發(fā)光試劑盒(Millipore，美國)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1缺血再灌注及缺血預(yù)處理模型的建立 腦缺血再灌注模型：使用Longa線栓法[3]以尼龍線栓(型號(hào):2634-A4,北京西濃科技有限公司,中國)阻斷大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈血流供應(yīng)，2 h后拉出恢復(fù)正常血流供應(yīng)。缺血預(yù)處理模型：按照上述方法，用線栓阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈10 min后拔出，恢復(fù)血流20 min，并重復(fù)3次，24 h后繼續(xù)制作缺血再灌注模型。假手術(shù)組只接受相同的麻醉和頸動(dòng)脈剝離過程，不阻斷大腦血流供應(yīng)。大鼠腦缺血再灌注模型建立成功后，將0.5 mg 3-MA加入500 mL生理鹽水中，制備1 mg/L濃度3-MA溶液，向D、E組大鼠側(cè)腦室注射7.5 μg 3-MA溶液，A、B、C組注射等量生理鹽水。

1.3.2神經(jīng)功能障礙評(píng)分 所有大鼠腦缺血再灌注后24 h評(píng)估神經(jīng)功能障礙評(píng)分：0分，無神經(jīng)功能障礙；1分，不能完全伸展左前肢；2分，爬行時(shí)左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，爬行時(shí)向左側(cè)傾倒；4分，無自主活動(dòng)能力及意識(shí)障礙。

其中B組死亡2只， D組死亡1只(蛛網(wǎng)膜下腔出血)，死亡與應(yīng)用3-MA無關(guān)。上述死亡實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均不納入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并隨機(jī)補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，保證每組20只。

1.3.3腦梗死體積的檢測(cè) 大鼠采用4%水合氯醛(100 mg/kg)麻醉，迅速取出腦，去掉嗅球及后腦，從額極開始切取4張冠狀腦片，厚約1.5 mm，立刻置于2% TTC溶液(pH值7.4，0.01 mol/L磷酸緩沖液配制)中，37 ℃避光孵育30 min。然后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死區(qū)呈現(xiàn)白色，非梗死區(qū)呈現(xiàn)紅色。應(yīng)用使用光學(xué)顯微鏡(BX-51/DP-72)高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)測(cè)出各區(qū)腦梗塞面積，根據(jù)公式V=t(A1+……+An)-(A1+An)t/2，算出梗死體積。其中t為切片厚度，A為梗死面積。

1.3.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)自噬標(biāo)志物 LC3-Ⅱ及Beclin-1水平 取右側(cè)海馬組織，制備腦組織切片(2 mm)，經(jīng)二甲苯脫蠟，再由乙醇水化至水。用10%正常馬血清阻斷PBS后，應(yīng)用兔抗大鼠LC3-Ⅱ和Beclin-1的多克隆抗體，并在恒溫4 ℃下過夜。然后調(diào)整溫度為37 ℃，用山羊抗兔抗體孵育15 min，滴入辣根過氧化物酶標(biāo)記，應(yīng)用濃縮型DAB試劑盒染色，充分顯色后封片。

每只大鼠隨機(jī)選取4張切片,使用光學(xué)顯微鏡(BX-51/DP-72，Olympus)查看神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)LC3-Ⅱ及Beclin-1陽性細(xì)胞(陽性細(xì)胞會(huì)被染色成灰色)，取平均值。

1.3.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取右側(cè)海馬組織切片(2 mm)遵按照制造商(德國曼海姆羅氏診斷公司)的方案，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)法標(biāo)記凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡400倍放大的條件下，連續(xù)選擇10個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域至少包含500個(gè)細(xì)胞。計(jì)算TUNEL染色陽性細(xì)胞占比(%)=TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)量×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分測(cè)定結(jié)果比較 A組腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分均為0；C組腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分小于B組；D組腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分大于B組，小于C組；E組腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分大于C組，小于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積和神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較 Table 1 Comparison of cerebral infarct volume and neurological dysfunction scores of rats in each group

2.2各組腦組織病理形態(tài)變化 在光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元：A組數(shù)量多，形態(tài)完整；其余4組數(shù)量少，形態(tài)破壞，細(xì)胞核破裂、固縮，其中最為嚴(yán)重的是B組和C組，D組和E組神經(jīng)元數(shù)量較B組和C組增多，細(xì)胞水腫及細(xì)胞核損傷減輕(圖1)。

2.3各組右側(cè)海馬組織Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 A組Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細(xì)胞表達(dá)少見；4組Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細(xì)胞表達(dá)多。C組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)大于B組，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)小于B組；D組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)及TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)小于B組和C組，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)大于B組和C組；E組Beclin-1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞數(shù)小于C組，TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)小于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2～4，表2。

表2 各組右側(cè)海馬組織Beclin-1、LC3-Ⅱ及TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of Beclin-1,LC3-Ⅱ and TUNEL staining-positive cells in the right hippocampus of each group

3 討 論

目前已有許多研究指出腦缺血預(yù)處理可以一定程度上減輕后續(xù)的腦梗死損傷，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[4-5]。缺血預(yù)處理是在隨后長期的或致命性的缺血損傷之前，事先對(duì)靶器官進(jìn)行一次或多次短暫性缺血適應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)器官損傷的一種方法，包括大腦、心臟、腎臟等器官都可從中受益[6]。但缺血預(yù)處理保護(hù)靶器官的分子機(jī)制尚不完全清楚。有研究報(bào)道，缺血預(yù)處理可以抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體失序和細(xì)胞凋亡[7]。同時(shí)，近年來有多種證據(jù)證實(shí)適度的自噬可能是缺血預(yù)處理發(fā)揮作用的重要調(diào)節(jié)劑[8-9]。LC3-Ⅱ水平一定程度上反映了細(xì)胞自噬的程度和自噬體的含量[10],缺血預(yù)處理的促進(jìn)自噬作用主要是通過LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)的[11]。更有研究提出，缺血預(yù)處理在再灌注期間可被自噬抑制劑3-MA明顯削弱其神經(jīng)保護(hù)作用[12]。

值得注意的是，能量傳感器腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)可能是缺血預(yù)處理對(duì)自噬調(diào)節(jié)的重要協(xié)調(diào)器[13-15]。有研究證實(shí)，缺血預(yù)處理可以激活A(yù)MPK磷酸化，啟動(dòng)細(xì)胞自噬，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，縮小腦梗死體積，起到神經(jīng)保護(hù)作用；而當(dāng)使用AMPK抑制劑時(shí)，幾乎完全使缺血預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用喪失[16]。但也有報(bào)道提示自噬的誘導(dǎo)劑雷帕霉素也可減輕腦損傷[17]。這一系列實(shí)驗(yàn)表明，自噬的確是缺血預(yù)處理發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的一種重要途徑，并且為腦梗死的治療提供潛在的策略。

但是，有學(xué)者提出相反的觀點(diǎn)，認(rèn)為在復(fù)雜的自噬信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Beclin-1具有調(diào)節(jié)自噬表達(dá)的作用，是誘發(fā)腦梗死自噬或細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)，若降低腦梗死自噬水平，可減少神經(jīng)元凋亡；敲除小鼠Beclin-1基因后，可顯著減少同側(cè)丘腦組織中雙膜自噬體的形成，并伴有TUNEL陽性凋亡神經(jīng)元的明顯減少[18]。表明通過抑制自噬水平可保護(hù)神經(jīng)元在缺血缺氧條件下免受損傷。

自噬與多種細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)過程相互作用，包括氧自由基積累、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，影響細(xì)胞活性[19]。研究自噬途徑在缺血性腦卒中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制越來越引起人們的興趣，部分原因是自噬可以在應(yīng)激條件下減少細(xì)胞損傷；學(xué)術(shù)界尚未就自噬在缺血性腦卒中的確切作用達(dá)成共識(shí)。目前普遍認(rèn)為，腦梗死激活的自噬對(duì)神經(jīng)元的存活有利有弊。但是,由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容繁雜，且具有異質(zhì)性，包括研究對(duì)象、年齡、細(xì)胞/動(dòng)物模型、腦組織缺血持續(xù)時(shí)間的差異等，都會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。目前認(rèn)為，適度的自噬可通過克服各種應(yīng)激刺激，增加細(xì)胞的生存能力。但是長時(shí)間缺血導(dǎo)致的過度自噬對(duì)神經(jīng)元是致命性的打擊[20]。因此可以推測(cè)，適度的自噬反應(yīng)可以通過腦血管短暫的缺血預(yù)處理激活，從而在缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，神經(jīng)元的損傷明顯減輕。

綜上所述，腦缺血預(yù)處理可以起到神經(jīng)保護(hù)作用，以適度激活自噬系統(tǒng)的方式來抑制神經(jīng)元凋亡。而腦缺血預(yù)處理的時(shí)間及強(qiáng)度可能是影響缺血性腦卒中神經(jīng)元自噬的重要因素，還需要進(jìn)一步研究。