高產(chǎn)堿性纖維素酶細(xì)菌的篩選鑒定及其酶學(xué)特性與發(fā)酵條件研究

馬振剛 熊亮 張真 羅堿

摘要：【目的】從自然環(huán)境中分離篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，開展堿性纖維素酶的酶學(xué)特性分析，為該菌株及所產(chǎn)纖維素酶的綜合開發(fā)利用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎敏燃谆w維素鈉（CMCNa）平板篩選法篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株，利用生理生化分析結(jié)合分子生物學(xué)法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并通過3，5-二硝基水楊酸（DNS）法研究其活性特征與發(fā)酵條件?！窘Y(jié)果】在長期覆蓋枯樹葉的土壤中分離獲得1株高產(chǎn)堿性纖維素酶的菌株，經(jīng)鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），名稱為B. cereus strain CQNUX 3-1。酶活性分析顯示該菌株胞外分泌液具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的活性，其酶活力分別達(dá)107.7、33.1和155.6 U/mL。酶學(xué)特征分析表明3種酶組分均具有較好的耐堿和一定的耐高溫能力。其中，內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最佳反應(yīng)溫度分別為70、60和40 ℃;最佳反應(yīng)pH分別為8.0、9.0和9.0;Fe3+能增加3種酶的酶活力，而β-葡萄糖苷酶具有較好的EDTA、尿素和Cu2+耐受性。發(fā)酵條件對(duì)菌株產(chǎn)酶的分析結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵溫度在37 ℃較適宜;發(fā)酵第4 d時(shí)的酶活力達(dá)最大值;該菌株能在堿性發(fā)酵環(huán)境下生長并產(chǎn)酶，在初始pH為7.0時(shí)發(fā)酵酶活力最高?！窘Y(jié)論】篩選獲得的纖維素酶高產(chǎn)菌株B. cereus strain CQNUX 3-1所生產(chǎn)的纖維素酶具有較高的反應(yīng)溫度適用性和較強(qiáng)的堿耐受性，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶溫度適中，且有較寬的發(fā)酵pH適用范圍，可作為堿性纖維素酶生產(chǎn)資源菌株，具有應(yīng)用于纖維素酶制劑制備與生產(chǎn)、纖維素資源綜合利用等領(lǐng)域的潛力。

關(guān)鍵詞： 堿性纖維素酶產(chǎn)生菌;篩選鑒定;酶學(xué)特性;發(fā)酵條件;蠟樣芽孢桿菌

中圖分類號(hào)： S154.39? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）03-0722-10

Screening and identification of a strain with high yield of alkaline cellulase and its enzyme characterizations and

fermentation conditions

MA Zhen-gang， XIONG Liang， ZHANG Zhen， LUO Jian

（College of Life Sciences， Chongqing Normal University， Chongqing? 401331， China）

Abstract：【Objective】Strains with high yield of cellulase were isolated from the natural environment，and the enzymatic characteristics of screened alkaline cellulase were analyzed which could lay a foundation for the comprehensive development and utilization of the cellulase produced by this strain. 【Method】The carboxymethyl cellulose sodium（CMCNa）plate screening method was used to isolate and screen high yield cellulose-producing strains and then the isolated strains were identified by physiological and biochemical analysis and molecular biology method. The characteristics of enzyme activity and fermentation conditions were studied by 3，5-dinitrosalicylic acid（DNS） method. 【Result】A high alkaline cellulase producing strain was isolated from the soil samples which were long-term covered by rotting leaves and this strain was identified and named as Bacillus cereus strain CQNUX 3-1. The results of enzyme activity tests showed that strain CQNUX 3-1 exhibited the activity of endoglucanase，exoglucanase and β-glucosidase and were 107.7，33.1 and 155.6 U/mL，respectively. Analysis of enzymatic characterization showed that the three enzymes had better alkaline resistance and certain high temperature performance. The optimum reaction temperature of endoglucanase，exoglucanase and β-glucosidase were 70，60 and 40 ℃，respectively. The best reaction pH were 8.0，9.0 and 9.0 respectively. Fe3+ could? increase the enzyme activity of three enzymes，while β-glucosidase showed better tolerance to EDTA，urea and Cu2+. The effect of fermentation conditions on the enzyme production showed that the optimum fermentation temperature of the strain was 37 ℃ and the enzyme activity could reach to the maximum after four days fermentation. Finally，the bacteria could grow and produce enzymes under alkaline fermentation environment. Enzyme activity was the best when the initial pH was 7.0. 【Conclusion】A strain with high alkaline cellulase producing is selected. The cellulase produced by B. cereus strain CQNUX 3-1 has high reaction temperature applicability and strong alkali resistance. The strain fermentation enzyme has moderate temperature and has a wide range of fermentation pH. This strain can be used as a alkaline cellulase production resource strain， with the potential for the preparation and production of cellulase preparations and the comprehensive utilization of cellulose resources.

Key words： alkaline cellulase producing strain; screening and identification; enzyme characterization; fermentation conditions; Bacillus cereus

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31770160）; Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Education Commission（KJQN201800524）

0 引言

【研究意義】纖維素是自然界中分布最廣、儲(chǔ)量最多的碳水化合物，占植物界碳含量的50%以上，為地球上最豐富的生物質(zhì)資源和天然可再生能源物質(zhì)（高鳳菊和李春香，2005;Ragauskas et al.，2006）。但由于植物纖維素具有不溶于水的結(jié)晶狀剛性結(jié)構(gòu)，且通常被木質(zhì)素層覆蓋或包圍，因此其開發(fā)利用面臨較大困難（高蕾蕾和李迎秋，2017），約有80%纖維素未得到充分利用，對(duì)纖維素廢棄物的大量丟棄或焚燒處理還帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題（師璐等，2017）。目前，降解天然纖維素的方法主要包括酸水解、熱化學(xué)處理及酶水解法等（劉鎖珠等，2017）。其中，酶水解法因具有快速、高效和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、食品工業(yè)、動(dòng)物生產(chǎn)和中藥成分提取等領(lǐng)域（趙君，2017）。尤其是在食品行業(yè)領(lǐng)域內(nèi)，纖維素酶在果蔬加工、白酒釀造、醬油釀造、食醋釀造、啤酒加工、飲料加工和茶葉加工等工藝過程中均具有重要作用（高蕾蕾和李迎秋，2017）。纖維素酶是由多種酶組成的多酶系統(tǒng)，包括纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）和α-葡萄糖苷酶（da Silva Delabona et al.，2012;Shanmugapriya et al.，2012）。但酶水解法在應(yīng)用過程中易受底物、反應(yīng)條件和酶活力等因素的影響，致使酶在諸多生產(chǎn)環(huán)境下無法有效水解纖維素而導(dǎo)致纖維素轉(zhuǎn)化率和降解物回收效率降低（Mojovi? et al.，2006;Eijsink et al.，2008）。因此，開發(fā)獲得高活力且對(duì)pH、溫度、離子及添加物等反應(yīng)條件具有較好耐受性的纖維素酶對(duì)提高酶水解法工作效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】產(chǎn)纖維素的真菌包括曲霉屬、鐮刀菌屬、青霉菌屬和木霉屬，是獲得水解植物纖維素所需的酶復(fù)合物的來源（da Silva Delabona et al.，2012）。其中，里氏木霉在工業(yè)乙醇生產(chǎn)業(yè)、食品業(yè)、飼料生產(chǎn)行業(yè)、紡織品和紙漿紙張生產(chǎn)領(lǐng)域已有推廣應(yīng)用（Fischer et al.，2020）;但絲狀真菌（包括曲霉屬、青霉屬和木霉屬等）因生長較慢、菌體產(chǎn)色、纖維素酶產(chǎn)物抑制及低酶活力等（Lo et al.，2005），在一定程度上限制了其在纖維素酶生產(chǎn)和纖維質(zhì)降解等領(lǐng)域的推廣與應(yīng)用（閆訓(xùn)友等，2004;文少白等，2010）。細(xì)菌因具有生長快、增殖周期短、代謝能力強(qiáng)等特點(diǎn)已成為獲得微生物源纖維素酶的理想來源之一（Rajendran et al.，2019）。至今，越來越多產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株被篩選獲得，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）（Hassan and Sohail，2020）、梭菌屬（Clostridium）（Gaur and Tiwari，2015）等均已用于生產(chǎn)纖維素酶。新的纖維素產(chǎn)生菌株，如藤黃色桿菌（Luteibacter）（李正風(fēng)等，2020）和纖維單胞菌（Cellulomonas）（Shi et al.，2020）等也陸續(xù)被篩選得到。作為菌株資源的篩選來源，土壤（Reddy et al.，2018）、沙漠 （Shi et al.，2020;Thamer and Pravej，2020）及垃圾堆（Ma et al.，2015）、腸道和糞便（Peristiwati et al.，2018;Rajendran et al.，2019）、秸稈堆肥（李正風(fēng)等，2020;Mohammadipour et al.，2020）等越來越受到研究人員的關(guān)注。其中，土壤作為資源微生物篩選的寶庫已成為各類微生物資源的重要篩選來源。Alvarado等（2020）利用新方法從土壤中分離出對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽性測(cè)試菌具有拮抗活性的放線菌;Rushabh等（2020）從番茄根際土壤中分離得到1株能產(chǎn)生吲哚-3-醋酸的細(xì)菌，并通過薄層色譜和高效液相對(duì)產(chǎn)物性質(zhì)進(jìn)行分析;Casta?eda-Cisneros等（2020）從山谷農(nóng)業(yè)土壤中分離出鏈霉菌，并對(duì)其產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶（CMCase）和木聚糖酶（Xyl）的產(chǎn)量進(jìn)行評(píng)價(jià);Koul等（2021）從桑樹組織和根際土壤中分離得到2株蛋白酶產(chǎn)生菌。另外，具有降解農(nóng)藥莠去津（Ye et al.，2016）、產(chǎn)生生物活性代謝物（Awad et al.，2018）、降解淀粉（Gudeta，2018）等能力的微生物也從土壤樣品中被篩選獲得?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于不同行業(yè)中纖維素酶的反應(yīng)條件迥異，生產(chǎn)條件也較苛刻，迫切需要在苛刻或極端條件下能有效降解的纖維素酶。已報(bào)道纖維素酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件與酶反應(yīng)條件較溫和，而針對(duì)高產(chǎn)量的極端條件纖維素降解菌的研究報(bào)道極為少見。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過平板篩選法，利用細(xì)菌鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒別系統(tǒng)鑒定分離獲得高產(chǎn)堿性纖維素酶菌株，并對(duì)該菌株的纖維素酶類型、產(chǎn)酶發(fā)酵條件和粗酶的最適反應(yīng)條件進(jìn)行全面分析，為該菌株及所產(chǎn)纖維素酶的綜合開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣品來源 土壤樣品采集于重慶師范大學(xué)（大學(xué)城校區(qū)）樹林下長期堆積腐爛枯葉的區(qū)域，分三點(diǎn)取樣，采樣深度10 cm。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 （1）羧甲基纖維素篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂20.0 g，NaCl 0.5 g，NaH2PO4 1.0 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1000 mL。（2）初步發(fā)酵培養(yǎng)基：CMCNa 5.0 g，蛋白胨2.5 g，酵母膏0.5 g，MgSO4 0.3 g，KH2PO4 2.0 g，NaCl 1.0 g，（NH4）2SO4 1.0 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4 0.0016 g，ZnCl2 0.0017 g，CoCl2 0.0017 g，蒸餾水1000 mL，自然pH。（3）LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1000 mL。（4）β-葡萄糖苷酶篩選培養(yǎng)基：含0.1%七葉苷和0.05%檸檬酸高鐵銨的LB的培養(yǎng)基。

1. 1. 3 試劑 （1）常用試劑：七葉苷和檸檬酸高鐵銨購于Sigma公司，剛果紅、濾紙和CMCNa購自生工生物工程（上海）股份有限公司。（2）DNS試劑：稱45.5 g酒石酸鉀鈉加入125 mL熱水中，攪拌溶解后加入1.575 g的3，5-二硝基水楊酸和65.5 mL的2 mol/L NaOH，再加入1.25 g重蒸酚和1.25 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，用蒸餾水定容至250 mL，貯存在棕色瓶中備用。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 纖維素酶產(chǎn)生菌初步篩選 取5.0 g樣品加入到495 mL蒸餾水中，37 ℃搖床振蕩15 min后靜置30 min，取100 μL懸濁液加入到900 μL滅菌水中，混勻，稀釋至10-1;各吸取50 μL 10-1濃度的土樣懸濁液，將稀釋液涂布在羧甲基纖維素瓊脂篩選培養(yǎng)基上，放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長情況及透明水解圈大小。

1. 2. 2 篩選平板復(fù)篩 觀察在篩選培養(yǎng)基上周圍有明顯透明水解圈的菌落，挑取透明圈直徑與菌落直徑比較大的菌株進(jìn)行多次重復(fù)劃線純化，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h直到獲得純菌株。將純化后的菌株接種至液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至渾濁，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 菌株形態(tài)學(xué)觀察與生理生化分析 取分離菌株劃線接種在固體LB培養(yǎng)基上以獲取單菌落，觀察菌落特征，包括顏色、光澤、表面狀況、形狀、大小和質(zhì)地等特征（張紀(jì)忠，1990）。生理生化特征分析主要參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》（周德慶，1986;Sneath et al.，1986）。

1. 2. 4 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 以分離菌株總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA序列的通用引物8F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃ 保存（陳麗燕等，2011）。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序獲得的序列通過NCBI在線BLAST程序進(jìn)行同源檢索并下載同源序列，使用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)，并通過MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 5 纖維素酶粗酶液制備 將分離菌株按20%的比例接種到含250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30 ℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1～6 d。每天取出1瓶發(fā)酵液，10000 r/min離心3 min，收集上清液即為細(xì)胞胞外酶液。

1. 2. 6 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定酶活力

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取104.8 mg恒重葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液備用。按照表1完成各試劑的添加及反應(yīng)，冷卻后分別在540 nm下比色，記錄吸光值（OD540），繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）菌株酶活力測(cè)定：分別以羧甲基纖維素鈉、濾紙和七葉苷為底物測(cè)定纖維素酶各組分（內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）的酶活力（Kirstahler et al.，2015）。0.5 mL菌體發(fā)酵上清液加入1.0 mL底物反應(yīng)液，再加入0.5 mL pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，在35 ℃水浴下反應(yīng)30 min;加入1.0 mL DNS顯色反應(yīng)液，沸水浴10 min，終止反應(yīng)。冷卻后補(bǔ)足至5.0 mL，540 nm波長下測(cè)定OD540。酶活力定義：在35 ℃下，1.0 mL酶液每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量，稱為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1. 2. 7 反應(yīng)條件對(duì)菌株酶活力的影響 取發(fā)酵培養(yǎng)2 d后離心收集的上清液作為粗酶液，保持反應(yīng)pH為7.0，測(cè)定不同反應(yīng)溫度（10、 20、30、40、50、60、70、80和90 ℃）對(duì)纖維素酶活力的影響。收集發(fā)酵4 d后的粗酶液，在40 ℃反應(yīng)條件下測(cè)定不同反應(yīng)pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0）對(duì)酶活力的影響。取發(fā)酵培養(yǎng)2 d后離心收集的上清液作為粗酶液，在溫度40 ℃和pH 7.0條件下，分別配制含有不同離子或化合物（K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Na+、Zn2+、EDTA和尿素）的反應(yīng)緩沖液，測(cè)定不同添加物對(duì)纖維素酶活力的影響。纖維素酶各組分的酶活力測(cè)定按前述方法進(jìn)行，每組試驗(yàn)均設(shè)3次獨(dú)立重復(fù)。

1. 2. 8 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化 將分離菌株按2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。在180 r/min轉(zhuǎn)速的振蕩培養(yǎng)條件下，分別測(cè)定培養(yǎng)基初始pH（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0）、培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40和45 ℃）及培養(yǎng)時(shí)間（1、2、3、4、5、6和7 d）對(duì)菌株產(chǎn)纖維酶活力的影響。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)條件下計(jì)算獲得3組平行試驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS 22.0對(duì)不同試驗(yàn)條件下所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2. 1 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選與分離結(jié)果

收集到的土壤樣品按前述方法進(jìn)行稀釋，均勻涂布于以CMCNa為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)72 h后，挑選透明圈直徑（H）和菌落直徑（C）比值最大的分離菌株進(jìn)行反復(fù)劃線純化，如圖1-A所示。結(jié)果表明，該分離菌株的H/C為5.08。在β-葡萄糖苷酶篩選培養(yǎng)基上菌落周圍能產(chǎn)生黑圈（圖1-B），表明其具有產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的能力。

2. 2 分離菌株的鑒定結(jié)果

2. 2. 1 菌落形態(tài)及生理生化鑒定 對(duì)純化獲得的細(xì)菌單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，其菌落為白色，偏大，扁平，圓形，邊緣不規(guī)則，不分泌色素（圖1-A）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其菌體呈長桿狀，革蘭氏陽性菌，無莢膜（圖1-C）。隨后，對(duì)分離菌株進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵、硝酸還原等生理生化鑒定，結(jié)果（表2）表明，該菌株為革蘭氏陽性菌，菌體為長桿狀，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖，可水解淀粉，七葉苷、接觸酶、尿素分解和硝酸還原試驗(yàn)等呈陽性，甲基紅（M.R）反應(yīng)和V-P試驗(yàn)呈陰性。各項(xiàng)生理生化指標(biāo)特征與芽孢桿菌屬的代表種一致（周德慶，1986）。

2. 2. 2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 提取分離菌株的基因組作為模板（圖2-A），采用細(xì)菌16S rDNA序列的通用擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，且其分子量約1.6 kb，結(jié)果如圖2-B所示。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得長度為1516 bp的DNA序列（GenBank登錄號(hào)MW314599）。多重序列比對(duì)分析結(jié)果表明，分離菌株的16S rDNA序列與B. cereus strain 55-4的16S rDNA具有最高的序列同源性。從GenBank中下載獲得系統(tǒng)發(fā)育分析所需的同源基因序列，使用ClustalX進(jìn)行多重序列對(duì)比后，用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，約束條件為Bootstrap方法1000個(gè)重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果（圖2-C）表明，分離菌株與B. cereus的不同分離菌株聚為一枝，且與B. cereus strain 55-4進(jìn)化距離最近。

綜上所述，分離菌株的菌落形態(tài)、生理生化特征與芽孢桿菌屬一致，16S rDNA序列與B. cereus strain 55-4的同源性達(dá)99%，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與B. cereus菌株能聚為一枝，表明其進(jìn)化關(guān)系較近。因此，確定分離菌株為蠟樣芽胞桿菌（B. cereus），其名稱為B. cereus strain CQNUX 3-1。

2. 3 纖維素酶各組分的酶活力分析結(jié)果

2. 3. 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 按前述方法，利用分光光度法獲得以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、OD540為縱坐標(biāo)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.8996x-0.0051，R2=0.9957。

2. 3. 2 不同底物條件下酶活力的測(cè)定 根據(jù)前述方法取發(fā)酵第4 d的粗酶液，底物分別為羧甲基纖維素鈉、濾紙和七葉苷，分別測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力。結(jié)果表明，粗酶液對(duì)3種底物均具有分解作用，其中降解七葉苷的β-葡萄糖苷酶活力高達(dá)155.6 U/mL，降解CMCNa的內(nèi)切葡聚糖酶活力為107.7 U/mL，降解濾紙的外切葡聚糖酶活力為33.1 U/mL。

2. 4 反應(yīng)條件對(duì)CQNUX 3-1菌株酶活力的影響

2. 4. 1 反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶各組分酶活力的影響

取發(fā)酵培養(yǎng)2 d后離心收集的上清液作為粗酶液，保持反應(yīng)pH為7.0，測(cè)定不同反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶活力的影響，結(jié)果（圖3-A）表明，溫度對(duì)纖維素酶各組分酶活力的影響有所不同。其中，β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，隨著反應(yīng)溫度的增加，其酶活力明顯下降，但直至溫度達(dá)80 ℃時(shí)仍能保留69%左右的酶活力，約為79.3 U/mL;而外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶受反應(yīng)溫度影響小，其最適溫度分別為60和70 ℃。

2. 4. 2 反應(yīng)pH對(duì)纖維素酶各組分酶活力的影響

收集發(fā)酵4 d后的粗酶液，在40 ℃的反應(yīng)條件下測(cè)定不同反應(yīng)pH對(duì)酶活力的影響，結(jié)果（圖3-B）表明，β-葡萄糖苷酶酶活力最高，其最適反應(yīng)pH為9.0;內(nèi)切葡聚糖酶最適反應(yīng)pH為8.0，且在pH達(dá)10.0時(shí)，仍保留92%的酶活力;外切葡聚糖酶活力受pH影響較低，在pH 7.0～9.0時(shí)酶活力相對(duì)較高。

2. 4. 3 離子和添加物對(duì)纖維素酶各組分酶活力的影響 取發(fā)酵培養(yǎng)2 d后離心收集的上清液作為粗酶液，在溫度為40 ℃和pH為7.0的條件下，分別配制含有各種離子的反應(yīng)緩沖液，測(cè)定不同離子及添加物對(duì)纖維素酶活力的影響，結(jié)果（圖3-C）表明，Ca2+、Fe3+和Cu2+離子可顯著促進(jìn)內(nèi)切纖維素酶的活力，K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+和Ba2+可增加β-葡萄糖苷酶的活力，僅Fe3+能促進(jìn)外切葡聚糖酶的活力?？梢?，F(xiàn)e3+在CQNUX 3-1菌株纖維素酶的應(yīng)用過程中可作為極佳的酶活力促進(jìn)離子。此外，Cu2+對(duì)外切葡聚糖酶有顯著的抑制作用，另外2種酶則具有良好的Cu2+耐受能力;β-葡萄糖苷酶對(duì)EDTA和尿素也具有較好的耐受性。

2. 5 發(fā)酵生產(chǎn)條件的優(yōu)化

2. 5. 1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶發(fā)酵的影響 制備發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床上對(duì)CQNUX 3-1菌株分別發(fā)酵培養(yǎng)2、3、4、5和6 d，離心獲得培養(yǎng)上清液作為粗酶液。在pH 7.0、40 ℃條件下反應(yīng)，測(cè)定發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶各組分酶活力的影響，結(jié)果（圖4-A）表明，內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵第4 d酶活力最高，縮短或延長發(fā)酵時(shí)間均使得酶活力明顯降低;而外切葡聚糖酶在發(fā)酵第2～3 d時(shí)酶活力較高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酶活力有較小程度的降低。因此，該菌株發(fā)酵的最佳時(shí)間應(yīng)控制在4 d。

2. 5. 2 初始pH對(duì)酶發(fā)酵的影響 使用具有不同初始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行發(fā)酵，分析初始pH對(duì)酶發(fā)酵的影響，結(jié)果（圖4-B）表明，β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵初始pH為7.0時(shí)的酶活力最高，且在pH 7.0～9.0時(shí)酶活力較穩(wěn)定;而當(dāng)pH達(dá)12.0時(shí)酶發(fā)酵受到明顯影響。外切葡聚糖酶在pH為5.0的條件下酶活力最高，pH 9.0～10.0時(shí)的酶活力為最高酶活力的77%，當(dāng)pH達(dá)12.0時(shí)酶發(fā)酵受到明顯抑制。內(nèi)切葡聚糖酶的活力在發(fā)酵pH為5.0時(shí)最高，其酶活力受發(fā)酵初始pH的影響較小。

2. 5. 3 發(fā)酵溫度對(duì)酶發(fā)酵的影響 分別在不同溫度下對(duì)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)4 d，粗酶液在pH 7.0、40 ℃的條件下反應(yīng)，測(cè)定不同發(fā)酵溫度對(duì)纖維素酶各組分酶活力的影響，結(jié)果（圖4-C）表明，β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶的最佳發(fā)酵溫度為37 ℃，在42 ℃時(shí)仍能分別獲得90%和66%的酶活力;而內(nèi)切葡聚糖酶的最適發(fā)酵溫度為30 ℃，其在37 ℃發(fā)酵可保留57%的酶活力。溫度低于25 ℃將不利于纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)。CQNUX 3-1菌株的最佳發(fā)酵條件符合工業(yè)上通過液體發(fā)酵獲得纖維素的發(fā)酵要求（閆訓(xùn)友等，2004）。

3 討論

纖維素作為最常見的有機(jī)聚合物，被認(rèn)為是通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)不同產(chǎn)品的最重要自然可再生資源（Rajendran et al.，2019），但目前約有80%的纖維素尚未得到充分利用而被廢棄，進(jìn)而引起環(huán)境污染等問題（Ragauskas et al.，2006;Illavarasi，2014）。微生物的酶解已被廣泛用于降解天然纖維素（Robson and Chambliss，1989），尋求高產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)微生物菌株成為高效降解纖維素的有效方法（Kersten and Cullen，2007）。本研究利用CMCNa平板篩選法，從長期覆蓋腐爛枯葉的土壤中篩選獲得1株高產(chǎn)堿性纖維素酶的菌株，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌，命名為B. cereus strain CQNUX 3-1。目前，產(chǎn)纖維素酶微生物的報(bào)道包括放線菌、細(xì)菌和真菌等，其中放線菌因其產(chǎn)酶量低而研究較少;真菌中的絲狀真菌因產(chǎn)酶活力較強(qiáng)而備受關(guān)注;而細(xì)菌也因?yàn)楫a(chǎn)量不高、產(chǎn)酶組分單一、分泌性差等原因很少在工業(yè)中被應(yīng)用，但細(xì)菌因其較快的發(fā)酵速度、較低的發(fā)酵營養(yǎng)條件要求等也具有較大的應(yīng)用潛力。尤其是污物纖維素類分解和飼料發(fā)酵等環(huán)節(jié)均在氧含量較低或缺氧的條件下進(jìn)行，此時(shí)厭氧及兼性厭氧型產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌更具應(yīng)用價(jià)值。出芽孢的細(xì)菌因能形成芽孢而對(duì)酸、堿和高溫環(huán)境耐受性較強(qiáng)，具有更高的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用潛力（吳敏峰等，2006）。因此，具有分泌能力且高產(chǎn)纖維素酶的出芽孢型細(xì)菌資源篩選對(duì)有效降解纖維素具有重要意義。目前，蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）已被報(bào)道能分泌產(chǎn)生蛋白酶（陳營等，2001）、膠原酶（李曄等，2016）和脂肪酶（韓雪和童攀，2017）等，是胞外酶生產(chǎn)的重要菌種資源。但蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)纖維素酶的研究較少，已報(bào)道的蠟樣芽胞桿菌菌株產(chǎn)酶的活力并不高，主要集中在4.95～66.22 U/mL（禤金彩等，2014;汪彬等，2016）。相對(duì)而言，CQNUX 3-1菌株具有較佳的纖維素酶生產(chǎn)能力，致使其在纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程中具有更佳的應(yīng)用潛力。

對(duì)菌株產(chǎn)生的纖維素酶組分分析結(jié)果表明，CQNUX 3-1菌株具有較高的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3種酶活力，分別達(dá)107.7、33.1和155.6 U/mL。近幾年，已報(bào)道來自自然界中的纖維素酶生產(chǎn)菌種達(dá)200多種（文少白等，2010），其中細(xì)菌種類繁多，包括纖維桿菌（Cellulomonas）、纖維粘菌（Cytophaga）及芽孢桿菌（Bacillus）等（劉娣，2008;陳麗燕等，2011），其內(nèi)切葡聚糖酶（或CMCase）活力為17.08～358.276 U/mL（何楠等，2017;羅奉奉等，2017）;而自然菌種經(jīng)誘變選育后其CMCase活力可達(dá)453.2 U/mL（郭建強(qiáng)等，2017）。因此，CQNUX 3-1菌株可作為高產(chǎn)纖維素酶菌種誘變選育的重要候選資源。對(duì)纖維素酶系各組分的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明內(nèi)切葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度為70 ℃，最適反應(yīng)pH為8.0;外切葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在pH 7.0～9.0時(shí)酶活力最高;β-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH為9.0。目前，已報(bào)道的微生物源纖維素酶的最適反應(yīng)溫度主要在45～65 ℃（高蕾蕾和李迎秋，2017），表明CQNUX 3-1菌株的纖維素酶具有較好的酶促反應(yīng)溫度適用性，具有作為優(yōu)良耐熱性堿性纖維素酶酶制劑而被應(yīng)用的前景。一般認(rèn)為，纖維素酶的最適反應(yīng)pH在4.0～5.5（張鳳梅，2016），而CQNUX 3-1菌株產(chǎn)生的纖維素酶各組分在堿性條件下均表現(xiàn)出較高的酶活力，暗示其在堿性工業(yè)生產(chǎn)過程中具有較好的應(yīng)用性（Long et al.，2020）。此外，Cu2+只對(duì)外切葡聚糖酶有顯著抑制作用，對(duì)其他2種酶的酶活力則具有良好的Cu2+耐受能力，較其他已報(bào)道的菌株具有明顯優(yōu)勢(shì)（趙玉蓉等，2005;Zhang et al.，2008）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶對(duì)EDTA和尿素有較好的耐受性，表明該纖維素酶在洗滌工業(yè)和食品加工業(yè)廢水處理過程中有較好的應(yīng)用前景。對(duì)菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果表明，CQNUX 3-1菌株各組分酶的最適發(fā)酵溫度為30～37 ℃，β-葡萄糖苷酶的最適發(fā)酵pH為7.0，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的最適發(fā)酵pH為5.0，且其在pH 7.0～10.0的堿性條件仍具有較高的發(fā)酵酶活力。內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最適發(fā)酵時(shí)間為4 d，而外切葡聚糖酶在發(fā)酵第2～3 d時(shí)的酶活力即達(dá)最高值。由此可見，CQNUX 3-1菌株具有較好的發(fā)酵耐酸堿性，且在較堿性發(fā)酵環(huán)境中仍具有較好的產(chǎn)酶能力。CQNUX 3-1菌株發(fā)酵產(chǎn)酶溫度適中，具有較寬的發(fā)酵pH條件適應(yīng)性，使該菌株能更好地適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)條件，提示其具備應(yīng)用于農(nóng)業(yè)廢棄物生物轉(zhuǎn)化、環(huán)境纖維質(zhì)污染物降解和纖維素資源綜合利用等領(lǐng)域的潛力，且可為之提供重要的菌株資源（Sadhu and Maiti，2013）。但本研究對(duì)該菌株所生產(chǎn)的純酶分離與酶活力分析尚待推進(jìn)，后續(xù)研究工作將重點(diǎn)開展CQNUX 3-1菌株所產(chǎn)纖維素酶的分離純化，并對(duì)純酶的比活力、酶活特性及底物降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，為該菌在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用打下更加全面、堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

篩選獲得的纖維素酶高產(chǎn)菌株B. cereus strain CQNUX 3-1所生產(chǎn)的纖維素酶具有較高的反應(yīng)溫度適用性和較強(qiáng)的堿耐受性，菌株發(fā)酵產(chǎn)酶溫度適中，且有較寬的發(fā)酵pH適用范圍，可作為堿性纖維素酶生產(chǎn)資源菌株，具有應(yīng)用于纖維素酶制劑制備與生產(chǎn)、纖維素資源綜合利用等領(lǐng)域的潛力。

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（責(zé)任編輯 王 暉）