高效液相色譜法檢測動物性產(chǎn)品中3種氟喹諾酮類藥物殘留的研究

方永衛(wèi) 師永華2 郭向陽

1.雙匯集團(tuán) 河南漯河 462300 2.漯河市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 河南漯河 462300

環(huán)丙沙星、恩諾沙星和麻保沙星均屬于氟喹諾酮類抗菌藥物，因其具有抗菌譜廣[1]、吸收率高、組織穿透力強(qiáng)和價格低廉的優(yōu)點，很快就被普遍應(yīng)用到動物性疾病的防治中。目前國內(nèi)獸用喹諾酮類藥物藥物的使用量已經(jīng)接近500t/年[2]。

但是集約化養(yǎng)殖，養(yǎng)殖環(huán)境比較差，動物容易感染疾病，還有為尋求快速的商業(yè)回報利益，很多養(yǎng)殖戶濫用氟喹諾酮類藥物或者違禁添加抗菌藥，這導(dǎo)致了動物性產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物含量的超標(biāo)。我國和世界衛(wèi)生組織、歐盟、日本等國家和組織，也都已經(jīng)將喹諾酮類藥物列入了限制使用的獸藥名單中[3]。所以，我們不僅要在源頭預(yù)防，加強(qiáng)對養(yǎng)殖戶的監(jiān)管；同時，還要致力于研究動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留的各種檢測方法，以利于相關(guān)執(zhí)法人員對動物性產(chǎn)品抗菌藥殘留的檢查更加方便、快速和準(zhǔn)確，以確保人們能夠食用健康安全的動物性產(chǎn)品。本實驗嘗試建立高效液相色譜法，測定動物性產(chǎn)品中3種氟喹諾酮類藥物含量水平的方法。主要包括：(1)通過紫外線掃描，確定這三種氟喹諾酮類藥物物質(zhì)的吸收波長范圍，然后選擇適宜的吸收波長進(jìn)行檢測；(2)流動相和檢測條件優(yōu)化，包括對流動相的組成成分及比例，還有檢測采用固相還是梯度洗脫及洗脫條件，進(jìn)樣量和流速等條件進(jìn)行一一優(yōu)化；(3)配制一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按照優(yōu)化好的色譜條件進(jìn)行上樣檢測，整理實驗結(jié)果，建立三種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其對應(yīng)檢測限；(4)采用最優(yōu)提取方案，進(jìn)行奶樣和肉樣的添加回收試驗，并測定這三種氟喹諾酮類的添加回收率。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

麻保沙星藥品，杭州創(chuàng)世紀(jì)醫(yī)藥科技有限公司；

環(huán)丙沙星藥品，杭州創(chuàng)世紀(jì)醫(yī)藥科技有限公司；

恩諾沙星藥品，杭州創(chuàng)世紀(jì)醫(yī)藥科技有限公司；

氫氧化鈉，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

無水硫酸鈉，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

乙酸，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

三乙胺，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

磷酸，開封開化(集團(tuán))有限公司；

正己烷，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

異丙醇，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

無水乙醇，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

甲醇(色譜純)，西隴化工股份有限公司；

乙睛(色譜純)，西隴化工股份有限公司；

純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；

注：以上無特殊標(biāo)注的試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

移液槍，鄭州博科儀器有限公司；

冰箱，河南新飛電器有限公司；

超聲波清洗器，金壇市吉特實驗儀器廠；

FA2004N電子分析天平，河北省虹宇設(shè)備有限公司；

超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

高效液相色譜儀，杭州爾首科學(xué)儀器有限公司；

紫外檢測器，惠州市華高儀器設(shè)備有限公司；

電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

低速離心機(jī)，金壇市恒豐儀器制造有限公司；

高速離心機(jī)，浙江三聯(lián)環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；

微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；

氮吹儀，青島國勝焊割設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目標(biāo)物最大吸收波長的確定

對環(huán)丙沙星溶液、恩諾沙星溶液和麻保沙星濃度均為25μg/mL的單標(biāo)溶液進(jìn)行掃描，麻保沙星吸收波長在298～299nm，恩諾沙星吸收波長278～180nm，環(huán)丙沙星吸收峰也在278nm左右。綜合實驗檢測結(jié)果和干擾因素考慮，選擇麻保沙星吸收波長為299nm，設(shè)置環(huán)丙沙星和恩諾沙星的吸收波長為278nm。

1.2.2 流動相和檢測條件的優(yōu)化

配制三種目標(biāo)物的混合目標(biāo)物溶液：準(zhǔn)確稱量三種標(biāo)準(zhǔn)品各3.5mg，放于同一玻璃瓶中，加入0.3mL的0.5moL/mL的氫氧化鈉助溶，再加入3.2mL的色譜甲醇，配成1mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻。再取其中混勻后溶液0.5mL，加入4.5mL的乙睛進(jìn)行稀釋成100μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。配制各種可能性較大的流動相，上樣檢測，再根據(jù)試驗現(xiàn)象進(jìn)一步調(diào)整改進(jìn)流動相組成，確定流動相和最佳檢測條件，流動相A液為0.05moL/L磷酸0.5%三乙胺溶液，B液為乙睛(色譜純)，進(jìn)行洗脫。開始流動相比例，A液為90%，B液為10%；隨后在18min內(nèi)流動相比例變?yōu)椋珹液為67%，B液為33%。柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL，流速為0.8mL/min。

1.2.3 三種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對濃度分別為2.5、5、8.3、25、100μg/mL的三種目標(biāo)物混合的檢測溶液，上樣檢測。以混合目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰積分面積為縱坐標(biāo)，制作麻保沙星、恩諾沙星和環(huán)丙沙星三種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。麻保沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=178.13X-526.47，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.997；環(huán)丙沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線其回歸方程為Y=177.21X-554.11，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9979；恩諾沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=202.66X-564.11，線性回歸相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998。

1.2.4 檢測限的測定

對濃度分別為0.25、0.5、1.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液上樣檢測，混合檢測液中麻保沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測限均為0.5μg/mL。

1.2.5 奶樣的前處理方法

用移液槍量1.0mL的奶樣于10mL的離心管中，加入3.0mL酸化乙腈溶液于超聲5min，3 500r/min離心5min，吸取上清液置另一管中。按照以上步驟再進(jìn)行處理1～2次，并與上一次清液放于同一管中。在上清液中加入3.0mL的正己烷，混合1min，3 500r/min離心5min，除去正己烷層。將下層即乙腈層轉(zhuǎn)移入50mL圓底旋蒸瓶中，加進(jìn)2.0mL的異丙醇，混勻，于45℃條件下減壓旋蒸至近干。用流動相把殘渣經(jīng)多次移入到離心管中，定容至1mL左右。再加入2.0mL正己烷，渦旋混合1min，3 500r/min離心5min，除去上層，底層用0.22um的濾膜過濾，于4℃下存放。

1.2.6 肉樣的前處理方法

稱1.0g豬樣于15.0mL離心管中，加2g無水硫酸鈉，混勻。加入4.0mL酸化乙腈，2 000r/min離心1min，超聲8min，2 500r/min離心5min，得上清液置25mL分液漏斗中。殘渣部分再加入4.0mL的酸化乙腈，用以上處理方法在進(jìn)行處理1～2次，把上清液放于25mL分液漏斗中，再加進(jìn)6.0mL的正己烷，充分搖勻2min后，靜置一段時間。取靜置后的基層清液置于50mL圓底燒瓶中，40℃旋蒸至近干，用氮吹儀吹干。用流動相溶解瓶中的殘渣，定容至1.0mL，加入1mL正己烷，13 000r/min離心8min，吸取底層的清液，經(jīng)過超濾后，于4℃下存放，備檢。

1.2.7 樣品的添加回收試驗

(1)空白樣檢測，從丹尼斯超市購買伊利純牛奶和優(yōu)質(zhì)肉品進(jìn)行檢測。

(2)添加回收試驗：在空白牛奶樣和豬肉樣品中進(jìn)行一系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的添加回收試驗。添加濃度為5.0，10.0，25.0，50.0μg/mL，共四個濃度進(jìn)行檢測，計算添加回收率。

2 結(jié)果分析

2.1 奶樣回收率的測定結(jié)果

對牛奶空白樣檢測，結(jié)果沒有出現(xiàn)明顯色譜峰。在牛奶中添加混和標(biāo)準(zhǔn)品的溶液，檢測結(jié)果如圖1、圖2，回收率測定結(jié)果如表1。

添加目標(biāo)物目標(biāo)物添加水平/ug·mL-1色譜峰積分面積回收體積/mL回收濃度/ug·mL-1回收率/%麻保沙星5.0983.0960.65.08101.110.01630.6960.89.6896.825.04070.4170.923.2292.950.08675.821.051.66103.3環(huán)丙沙星5.0979.5450.65.19103.810.01557.2630.89.6296.225.03919.8390.922.7290.850.08280.63771.049.8599.7恩諾沙星5.01158.1820.65.089101.910.01914.6750.89.7897.825.04842.0410.924.0096.050.010125.11.052.74105.4

結(jié)果顯示：這種牛奶提取方法的麻保沙星回收率在92.9%～103.3%之間；環(huán)丙沙星的回收率在90.8%～103.8%之間；恩諾沙星的回收率在96.0%～105.4%之間。表明這個試驗確立這種牛奶提取方法可靠性良好，可以用于牛奶中這三種物質(zhì)的提取檢測。

2.2 肉樣回收率的測定結(jié)果

對肉品的空白樣檢測，檢測結(jié)果圖譜中沒有出現(xiàn)明顯色譜峰。肉品中添加混和標(biāo)準(zhǔn)品的溶液檢測結(jié)果如圖3、圖4，回收率測定結(jié)果表2。

添加目標(biāo)物目標(biāo)物添加水平/ug·mL-1色譜峰積分面積回收體積/mL回收濃度/ug·mL-1回收率/%麻保沙星5.0580.9580.84.9699.310.01748.6870.810.21102.125.04317.5570.924.4797.850.08397.0631.050.09100.1環(huán)丙沙星5.0509.7200.84.8096.010.01263.0620.88.2082.025.03721.9230.921.7186.850.07953.7901.048.0096.0恩諾沙星5.0604.8670.84.6192.210.02028.7600.810.23102.325.05157.0820.925.40101.650.09956.8731.051.91103.8

結(jié)果顯示：在肉樣添加回收試驗中，測得麻保沙星的回收率在97.8%～104.7%之間；測得環(huán)丙沙星的回收率在82.0%～96.0%之間；恩諾沙星的回收率在101.6%～105.6%之間。表明這個試驗確定的這種方法可靠性良好。

3 結(jié)論

本文成功建立了高效液相色譜法測定動物性產(chǎn)品3種氟喹諾酮類藥物殘留的方法，對實驗結(jié)果進(jìn)行整理綜合，得出結(jié)論。

(1)麻保沙星吸收波長在298～299nm，恩諾沙星吸收波長在278～180nm，環(huán)丙沙星吸收峰在278nm左右。綜合考慮，選擇高效液相檢測中麻保沙星吸收波長為299nm；設(shè)置環(huán)丙沙星和恩諾沙星的吸收波長均為278nm。

(2)確定相流動為A液為0.05moL/L磷酸0.5%三乙胺溶液，B液為乙睛，進(jìn)行梯度洗脫，初始比例A∶B=9∶1(v/v)，在18min內(nèi)流動相B液由10%上升到33%。柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL，流速為0.8mL/min進(jìn)行測定，可得到最佳色譜分離圖。

(3)建立的麻保沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線，性回歸方程為Y=178.13X-526.47，其相關(guān)系數(shù)為0.9970。環(huán)丙沙星線性回歸方程為Y=177.21X-554.11，相關(guān)系數(shù)為0.9979。恩諾沙星線性回歸方程為Y=202.66X-564.11，相關(guān)系數(shù)為0.998。表明這三種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合效果良好。這三種物質(zhì)的檢測限均為0.5μg/mL。

(4)在牛奶提取方法中，三種目標(biāo)物在牛奶中不同添加濃度的回收率均在97.8%～105.4%之間，肉品的添加回收率均在82.0%～105.6%之間。這表明試驗建立的這種牛奶提取方法和肉品提取方法的可靠性良好，可以用于牛奶和肉品中這三種物質(zhì)的提取檢測。