犢牛腹瀉大腸桿菌血清型鑒定

吳孟 覃杰

（新疆第二師畜牧獸醫(yī)工作站 841005）

近年來(lái)，巴州地區(qū)犢牛腹瀉的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的一個(gè)重要原因。犢牛腹瀉造成犢牛生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或死亡，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。因大腸桿菌血清型較多，變異較大，給大腸桿菌引起的腹瀉防治帶來(lái)困難，故本試驗(yàn)檢測(cè)巴州地區(qū)致?tīng)倥８篂a大腸桿菌的血清型，找到優(yōu)勢(shì)血清型，為犢牛腹瀉的防治提供參考。

1 材料

1.1 病料

2019～2020 年間，采用滅菌棉簽采集巴州地區(qū)6 家規(guī)模牛場(chǎng)、12 家散養(yǎng)戶(hù)的共75 頭腹瀉犢牛深部直腸糞便拭子樣品，同時(shí)采集病死犢牛的臟器樣品，樣品采集后24h 內(nèi)做細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定。

1.2 藥品和主要試劑

普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。細(xì)菌生化微量鑒定培養(yǎng)基，按常規(guī)方法配置。血清型檢測(cè)試劑購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)督所。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離鑒定

棉簽拭子接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯溶液，剪碎臟器樣品接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯溶液，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，形成增菌液，將增菌液用接種環(huán)在麥康凱平板連續(xù)劃線(xiàn)，37℃培養(yǎng)18～24h 后觀(guān)察培養(yǎng)特性，然后從每個(gè)平板挑取磚紅色、圓形凸起的菌落，接種于伊紅亞甲藍(lán)瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)18～24h，觀(guān)察分離細(xì)菌生長(zhǎng)的菌落特點(diǎn)，同時(shí)用該菌落涂片，革蘭染色、鏡檢，然后挑取典型菌落再接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純菌增殖。生化試驗(yàn)按陸承平[1]介紹的方法對(duì)所有分離細(xì)菌進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。

2.2 血清型鑒定試驗(yàn)

將分離純化的大腸桿菌接種于普通液體培養(yǎng)基中，置恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20h，121℃高壓1.5h 破壞K 抗原，即為“O”抗原。用0.5%生理鹽水洗下菌苔，得到細(xì)菌懸液，取一潔凈的載玻片，一邊滴加20μL 的0 抗原多價(jià)血清，另一邊滴加20μL 的生理鹽水作為陰性對(duì)照，分別加入10μL 細(xì)菌懸液，混合均勻，與血清充分混勻后在1min 內(nèi)觀(guān)察結(jié)果，有明顯凝集現(xiàn)象的為陽(yáng)性，呈陽(yáng)性者再與單因子血清反應(yīng)，測(cè)定該菌株的血清型。生理鹽水對(duì)照應(yīng)沒(méi)有凝集現(xiàn)象。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離鑒定

在麥康凱培養(yǎng)基上菌落表現(xiàn)為圓形、隆起、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、紅色菌落，在伊紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出有金屬光澤的黑色菌落。菌株經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為陰性短桿菌，兩端鈍圓，無(wú)芽孢，單個(gè)存在，初步確定為大腸桿菌。共從75 份樣品中分離鑒定出39 株大腸桿菌，大腸桿菌檢出率52.0%。

3.2 生化試驗(yàn)

對(duì)初步分離鑒定的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，葡萄糖、乳糖、吲哚、木糖、甘露醇、麥芽糖、硝酸鹽陽(yáng)性、VP、棉籽糖陰性，均符合大腸桿菌的生化特性。

3.3 血清型鑒定試驗(yàn)

對(duì)分離的39 株大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，其中36 株確定了血清型，共有6 種血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O111。具體結(jié)果見(jiàn)附表。

4 討論

本試驗(yàn)從75 份犢牛腹瀉樣品中分離得到39 株大腸桿菌樣品，大腸桿菌檢出率52.0%，可見(jiàn)大腸桿菌為巴州地區(qū)犢牛腹瀉的一個(gè)重要病原，對(duì)犢牛腹瀉防治可以考慮大腸桿菌引起。

本試驗(yàn)中，大腸桿菌的血清型有6 種，分別為O8、O26、O35、O78、O101、O111，其中O78、O111 明顯高于其他3種，為優(yōu)勢(shì)血清型。與喻華英[2]報(bào)道的新疆部分地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌血清型完全不一致，與李慧[3]報(bào)道的新疆石河子地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌血清型只有O78 一致，這可能不同地區(qū)大腸桿菌血清型存在地區(qū)差異[4]。本試驗(yàn)中有3 株大腸桿菌未鑒定出血清型，這可能與購(gòu)買(mǎi)的檢測(cè)試劑沒(méi)有相應(yīng)的血清型有關(guān)。