光學(xué)法血小板計數(shù)在小紅細(xì)胞性貧血患者中的應(yīng)用

王楠 譚俊青 鐘廣智 黃靜蓉 李冉 黎翠翠

1廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510095；2廣州華銀醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 510663

血常規(guī)是臨床常規(guī)檢查項(xiàng)目，血小板計數(shù)更是其中一項(xiàng)重要指標(biāo)。血小板準(zhǔn)確計數(shù)對臨床診斷和治療疾病具有重要意義［1］。目前臨床實(shí)驗(yàn)室血小板計數(shù)普遍采用全自動血細(xì)胞分析儀電阻抗法［2］。但其結(jié)果易受小紅細(xì)胞、異常血小板（比如大血小板、形狀不規(guī)則的血小板、血小板聚集）、脂肪乳、紅細(xì)胞碎片或白細(xì)胞碎片等干擾，影響血小板計數(shù)的準(zhǔn)確性［3-8］。本實(shí)驗(yàn)的日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀除電阻抗法還可用光學(xué)法進(jìn)行血小板計數(shù)。本研究以手工法作為金標(biāo)準(zhǔn)，分別用光學(xué)法和電阻抗法對EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本進(jìn)行血小板計數(shù)，對3種方法的計數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較及相關(guān)性分析，探討光學(xué)法血小板計數(shù)在小紅細(xì)胞性貧血患者中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集廣東省第二中醫(yī)院2019年12月至2020年3月就診小紅細(xì)胞性貧血患者的含EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本109份，均獲得患者知情同意。根據(jù)平均紅細(xì)胞體積（MCV）大小分成3組，其中MCV＜70 fl的標(biāo)本43份，再按紅細(xì)胞分布寬度（RDW）大小進(jìn)行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組；70 fl≤MCV＜80 fl的標(biāo)本32份；MCV≥80 fl的標(biāo)本34份。標(biāo)本選用無溶血、無脂血、無凝塊含EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本。標(biāo)本采集時，應(yīng)避免因采血不暢而導(dǎo)致血小板被破壞，引起血小板計數(shù)假性降低。在采集后2 h內(nèi)完成檢測。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 手工法日本OLYMPUS雙目顯微鏡，牛鮑改良血細(xì)胞計數(shù)板，瑞氏染液，血小板稀釋液按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）［9］的要求配制。

1.2.2 電阻抗法和光學(xué)法日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀及其原裝配套的試劑和質(zhì)控品。

1.3 檢測方法

1.3.1 手工法方法參考《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）的血小板計數(shù)。先對血液進(jìn)行上下顛倒混勻10次，取一支試管加入0.38 ml的1%草酸銨溶液，接著用移液槍吸取20 μl血液加入試管震蕩混勻，靜置至溶血后再混勻，制成血小板懸液；然后用微量采血管取一滴血小板懸液進(jìn)行充池，靜置15 min，當(dāng)血小板充分下沉后由2名檢驗(yàn)人員采用雙盲法進(jìn)行計數(shù)，分別計算4個角落和中央共5個中方格，最后根據(jù)公式計算結(jié)果。每份標(biāo)本計數(shù)2次取其平均值；取一滴血液標(biāo)本滴于載玻片右端，取另一張載玻片作為推片。推片與載玻片呈45°，推片末端置于血滴左側(cè)，緩慢地向后拉，使之與血液接觸，然后向前推片，動作要平穩(wěn)使血液在載玻片上形成一層均勻的薄血膜，且要求頭尾分明。用手輕扇使血膜快速干燥，然后再用瑞氏染料按照其說明書對血膜進(jìn)行染色。待玻片干燥后在顯微鏡下觀察排除異常血小板、血小板聚集等現(xiàn)象的標(biāo)本［9］。

1.3.2 電阻抗法和光學(xué)法采用日本SYSMEX XE-5000i全自動血液分析儀，按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行質(zhì)控和標(biāo)本檢驗(yàn)。標(biāo)本檢驗(yàn)采用模式5（CBC+RET），該方法可在血小板參數(shù)同時查看電阻抗法和光學(xué)法的數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS Statistics v23 x86軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較，先采用完全隨機(jī)設(shè)計方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Person相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，r＞0.95認(rèn)為存在顯著性相關(guān)，r＞0.80認(rèn)為高度相關(guān)。

2 結(jié) 果

2.1 3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法比較結(jié)果較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），光學(xué)法與電阻抗法比較結(jié)果較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），光學(xué)法與手工法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl時，電阻抗法和光學(xué)法與手工法比較結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 小紅細(xì)胞性貧血患者全血標(biāo)本3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較（×109/L，）

表1 小紅細(xì)胞性貧血患者全血標(biāo)本3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較（×109/L，）

注：MCV為平均紅細(xì)胞體積；與手工法比較，aP＜0.05；與電阻抗法比較，bP＜0.01

MCV MCV＜70 fl 70 fl≤MCV＜80 fl MCV≥80 fl P值0.003 0.731 0.340份數(shù)43 32 34手工法315.162±63.765 288.091±73.942 283.762±75.255電阻抗法341.423±92.312a 290.696±102.267 278.213±74.401光學(xué)法320.633±77.014b 285.166±82.878 281.712±65.713 F值4.271 0.352 0.973

2.2 3種方法血小板計數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法、光學(xué)法與手工法及電阻抗法與光學(xué)法血小板計數(shù)結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r分別為0.914、0.921和0.945；70 fl≤MCV＜80 fl時，r分別為0.935、0.943和0.978；MCV≥80 fl時，r分別為0.926、0.888和0.962。見表2。

表2 小紅細(xì)胞性貧血患者全血標(biāo)本3種方法血小板計數(shù)結(jié)果相關(guān)性分析（r值）

2.3 MCV＜70 fl時不同RDW分組3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較當(dāng)MCV＜70 fl時，進(jìn)一步按RDW進(jìn)行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組。當(dāng)RDW＜17%時，電阻抗法與手工法結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），光學(xué)法與手工法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)RDW≥17%時，電阻抗法和光學(xué)法與手工法結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表3。

表3 MCV＜70 fl時不同RDW分組小紅細(xì)胞性貧血患者全血標(biāo)本3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較（×109/L）

表3 MCV＜70 fl時不同RDW分組小紅細(xì)胞性貧血患者全血標(biāo)本3種方法血小板計數(shù)結(jié)果比較（×109/L）

注：MCV為平均紅細(xì)胞體積，RDW為紅細(xì)胞分布寬度；與手工法比較，aP＜0.05，bP＜0.01

RDW RDW＜17%RDW≥17%P值0.012 0.005份數(shù)29 14手工法296.666±63.981 338.142±55.393電阻抗法316.342±86.147a 393.367±85.101b光學(xué)法298.863±71.045 365.710±71.033b F值2.939 3.078

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高，人們越來越追求更便捷更準(zhǔn)確的檢查方法。目前血小板計數(shù)常用的方法有手工法、電阻抗法、光學(xué)法、熒光染料結(jié)合法和流式細(xì)胞術(shù)［10-12］。

早期血小板計數(shù)采用手工法，對時間有一定要求，要求檢測人員經(jīng)過嚴(yán)格的專業(yè)訓(xùn)練以及豐富的工作經(jīng)驗(yàn)，雖容易受主觀因素影響，但其優(yōu)點(diǎn)也不可忽視［13］。手工法可以排除其他細(xì)胞比如小紅細(xì)胞、異常血小板比如大血小板，形狀不規(guī)則的血小板、脂肪乳、紅細(xì)胞碎片或白細(xì)胞碎片以及EDTA-K2依賴的血小板聚集對血小板計數(shù)的干擾［14］。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高和標(biāo)本量增加，全自動血液細(xì)胞計數(shù)儀得到了普遍和廣泛的應(yīng)用［6］。電阻抗法測血小板是通過阻抗信號來進(jìn)行細(xì)胞分類的，電阻抗信號越小，細(xì)胞的直徑就越小，與細(xì)胞內(nèi)容物無關(guān)，只與細(xì)胞直徑相關(guān)。與手工法相比，電阻抗法檢測時間較短，操作更簡便。光學(xué)法是通過接收到的前向散射光和側(cè)向散射光信號，前者與細(xì)胞大小相關(guān)，后者與細(xì)胞內(nèi)容物結(jié)構(gòu)相關(guān)，然后綜合分析對細(xì)胞進(jìn)行分類。所以光學(xué)法與電阻抗法相比，前者可以排除因?yàn)榧t細(xì)胞碎片，小紅細(xì)胞引起的血小板計數(shù)產(chǎn)生的誤差［4，15-17］。熒光染料結(jié)合法是利用熒光染料來計數(shù)血小板。熒光染料結(jié)合法比光學(xué)法測得血小板更多，光學(xué)法只能測得成熟的血小板，熒光染料結(jié)合法還可以測未成熟血小板。而且熒光染料結(jié)合法也可以排除血細(xì)胞碎片，小紅細(xì)胞、異常血小板對血小板計數(shù)的干擾。流式細(xì)胞術(shù)利用抗原抗體結(jié)合來區(qū)分血小板與其他細(xì)胞，具有較強(qiáng)的特異性，但對于抗體的要求較高，要求抗體能識別所有的血小板，因此對技術(shù)和成本要求比較高，不利于在常規(guī)篩查中應(yīng)用［18］。

有研究表明，在血細(xì)胞形態(tài)正常及無溶血、脂血、血小板凝集的情況下，手工法、電阻抗法、光學(xué)法都可以滿足日常檢測的需要［19］。在面對血細(xì)胞形態(tài)正常的標(biāo)本時，電阻抗法和光學(xué)法都有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，雖然存在不同程度的誤差但在可允許范圍內(nèi)。但是對于小細(xì)胞性貧血患者的標(biāo)本來說，里面含有的小紅細(xì)胞會對電阻抗法血小板計數(shù)進(jìn)行干擾，由于方法學(xué)的局限性，電阻抗法會將小紅細(xì)胞誤認(rèn)為是血小板，使血小板假性升高。光學(xué)法利用接收到的前向散射光和側(cè)向散射光信號從而區(qū)分血小板和小紅細(xì)胞，可避免出現(xiàn)誤判。所以在面對這一類標(biāo)本時，在沒有血小板聚集的情況下，光學(xué)法要優(yōu)于電阻抗法［20-22］。

本研究首先以MCV進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)3組之間血小板計數(shù)結(jié)果均具有良好的相關(guān)性。MCV＜70 fl時，電阻抗法與手工法比較結(jié)果偏高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；電阻抗法與光學(xué)法比較結(jié)果較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；70 fl≤MCV＜80 fl和MCV≥80 fl時，電阻抗法和光學(xué)法與手工法結(jié)果比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），研究結(jié)果與報道相符。因此，對于MCV≥70 fl的標(biāo)本，臨床常規(guī)采用全自動血細(xì)胞分析儀電阻抗法進(jìn)行血小板計數(shù)對結(jié)果無影響。

對于MCV＜70 fl的標(biāo)本，手工法鏡檢發(fā)現(xiàn)部分血片可見紅細(xì)胞大小不均、紅細(xì)胞碎片、橢圓形紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞等。有研究報道，RDW異常也會對血小板計數(shù)造成影響［23-24］。因此，當(dāng)MCV＜70 fl時，我們進(jìn)一步以RDW進(jìn)行分組，RDW＜17%為正常組，RDW≥17%為異常組。當(dāng)RDW＜17%時，電阻抗法與手工法血小板計數(shù)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），光學(xué)法與手工法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)RDW≥17%時，電阻抗法和光學(xué)法與手工法結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。結(jié)果提示，當(dāng)MCV＜70 fl、RDW＜17%時，小紅細(xì)胞干擾會導(dǎo)致電阻抗法血小板計數(shù)偏高，應(yīng)采用光學(xué)法或手工法復(fù)檢；但MCV＜70 fl、RDW≥17%時，小紅細(xì)胞大小不均也可影響光學(xué)法血小板計數(shù)，應(yīng)采用手工法復(fù)檢。

本研究由于樣本量有限，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本容量，盡量降低代表性誤差帶來的影響。本研究的目的是探討光學(xué)法在小紅細(xì)胞性貧血患者中的應(yīng)用，在面對這一類標(biāo)本時，光學(xué)法要優(yōu)于電阻抗法。但是在出現(xiàn)MCV＜70 fl且RDW≥17%、血小板直方圖出現(xiàn)異?；蚣?xì)胞計數(shù)儀結(jié)果出現(xiàn)提示血小板聚集時建議采用手工法進(jìn)行血小板計數(shù)，必要時可涂片染色鏡檢。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。